胸部血管周脂肪通過(guò)褐變分泌組抑制小鼠平滑肌細(xì)胞凋亡及主動(dòng)脈瘤形成

腹主動(dòng)脈瘤作為腹主動(dòng)脈的yongjiu性擴(kuò)張病變，因可能引發(fā)破裂猝死而導(dǎo)致全球每年超 17.5 萬(wàn)人死亡，且目前缺乏有效藥物治療，亟需探索新機(jī)制與策略。血管周?chē)�脂肪組織（PVAT）作為環(huán)繞血管的特殊脂肪組織，不僅能調(diào)節(jié)血管收縮功能、參與高血壓發(fā)展，還通過(guò)影響血管平滑肌細(xì)胞的增殖遷移、分泌脂肪因子和細(xì)胞因子等，參與新內(nèi)膜增生及動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。近年來(lái)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，PVAT 可能通過(guò)炎癥基因表達(dá)和脂肪因子分泌，與腹主動(dòng)脈瘤的病理生理過(guò)程相關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)主動(dòng)脈不同區(qū)域的 PVAT 存在表型差異，且這與血管疾病相關(guān)。有研究表明腹主動(dòng)脈比胸主動(dòng)脈更易發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化，胸主動(dòng)脈瘤（TAA）的發(fā)病率和生長(zhǎng)速度也遠(yuǎn)低于腹主動(dòng)脈瘤（AAA），這提示胸部血管周?chē)�脂肪組織可能對(duì)主動(dòng)脈瘤形成具有保護(hù)作用。

基于此，廣東省惡性腫瘤表觀遺傳 與基因調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的醫(yī)學(xué)研究中心，聚焦于 T-PVAT 移植對(duì)主動(dòng)脈瘤形成的影響及其對(duì)血管平滑肌細(xì)胞的作用展開(kāi)研究。研究成果發(fā)表在Acta pharmacologica Sinica期刊，題為“Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes”。

首先，研究人員對(duì)比小鼠胸部（T-PVAT）與腹部（A-PVAT）血管周?chē)�脂肪組織的表型差異，發(fā)現(xiàn)二者存在顯著區(qū)別。組織學(xué)上，T-PVAT 由多泡脂肪細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞平均尺寸更小，而 A-PVAT 以單泡脂肪細(xì)胞為主（圖 1a、b）。分子層面，T-PVAT 中經(jīng)典褐變標(biāo)志物 Ucp1 的蛋白表達(dá)量高（圖 1c、d），且 Ucp1、Ppar-α 等棕色脂肪細(xì)胞標(biāo)志物的 mRNA 表達(dá)水平均顯著高于 A-PVAT（圖 1e）。這些結(jié)果表明，T-PVAT 比 A-PVAT 更具棕色脂肪樣表型。

圖1    T-PVAT 比 A-PVAT 更具棕色脂肪樣表型

接著，為了研究腹主動(dòng)脈周?chē)?PVAT 變化對(duì) AAA 形成的影響，研究人員將 T-PVAT 或 A-PVAT 移植到經(jīng)磷酸鈣處理的小鼠腹主動(dòng)脈上（磷酸鈣可誘導(dǎo) AAA）（圖 2a）。結(jié)果顯示，磷酸鈣處理 14 天后小鼠主動(dòng)脈顯著擴(kuò)張，而移植 T-PVAT 能顯著抑制這種擴(kuò)張（圖 2b–d）。HE 染色也證實(shí)，T-PVAT 移植可有效抑制主動(dòng)脈管腔擴(kuò)張和外膜增厚（圖 2e）。這些結(jié)果表明，T-PVAT 移植具有減輕腹主動(dòng)脈瘤形成的作用。

圖2    T-PVAT 移植可減輕 AAA 的形成

研究人員進(jìn)一步探究了 T-PVAT 移植對(duì)腹主動(dòng)脈壁結(jié)構(gòu)的影響。EVG 染色顯示，假手術(shù)組和 A-PVAT 移植組中，磷酸鈣會(huì)強(qiáng)烈誘導(dǎo)致彈性蛋白斷裂，而 T-PVAT 移植能顯著減輕這種斷裂（圖 3a、c）。天狼星紅染色則表明，T-PVAT 移植可顯著增加腹主動(dòng)脈壁中膠原的沉積面積（圖 3b、d）。這些結(jié)果表明 ，T-PVAT 移植可顯著減輕主動(dòng)脈中膜彈性蛋白斷裂，并增加主動(dòng)脈壁的膠原沉積。

圖3    T-PVAT 移植可減輕腹主動(dòng)脈壁彈性蛋白斷裂并增加膠原沉積

平滑肌細(xì)胞是動(dòng)脈壁的重要組成部分，其缺失會(huì)導(dǎo)致主動(dòng)脈基質(zhì)退化及擴(kuò)張破裂。研究人員通過(guò)相關(guān)染色分析發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組和 A-PVAT 移植組經(jīng)磷酸鈣處理后，主動(dòng)脈中膜平滑肌細(xì)胞因凋亡大量缺失（圖 4a、d）。而 T-PVAT 移植不僅顯著增加了主動(dòng)脈壁中平滑肌細(xì)胞的含量，還降低了凋亡標(biāo)志物 cleaved-caspase3 的表達(dá)（圖 4b、e），減少了 TUNEL 陽(yáng)性凋亡細(xì)胞。（圖 4c、f）。這表明 T-PVAT 移植可通過(guò)抑制平滑肌細(xì)胞凋亡，維持主動(dòng)脈壁中平滑肌細(xì)胞的含量。

圖4    T -PVAT 移植可維持主動(dòng)脈壁中膜平滑肌細(xì)胞的含量

然后，為了探究 T-PVAT 對(duì)平滑肌細(xì)胞的直接作用，研究人員將血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）與分離的 PVAT 進(jìn)行共培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用 H₂O₂或 TNFα 聯(lián)合 CHX 誘導(dǎo) VSMCs 凋亡時(shí)，與對(duì)照組或 A-PVAT 相比，T-PVAT 可顯著降低凋亡相關(guān)蛋白（cleaved-Caspase 3、cleaved-Parp）的表達(dá)（圖 5a–c、f–h）。流式細(xì)胞術(shù)也證實(shí)，T-PVAT 能顯著減少上述誘導(dǎo)條件下 VSMCs 的凋亡（圖 5d、e、i、j）。綜上，T-PVAT 對(duì) VSMC 凋亡具有直接的抑制作用。

圖5    T-PVAT 共培養(yǎng)可抑制 VSMC 凋亡

為了明確 T-PVAT 的作用機(jī)制，研究人員通過(guò) RNA 測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)其與 A-PVAT 存在顯著基因表達(dá)差異（圖 6a），其中 1609 個(gè)基因上調(diào)、3225 個(gè)基因下調(diào)（圖 6b）。對(duì)上調(diào)基因的 GO 富集分析顯示，其主要集中于線粒體代謝和棕色脂肪細(xì)胞分化等褐變脂肪細(xì)胞的典型特征（圖 6c）。進(jìn)一步分析上調(diào)的分泌蛋白編碼基因發(fā)現(xiàn)，“凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控” 是顯著富集的條目之一（圖 6d）。這些結(jié)果表明，T-PVAT 富含褐變脂肪細(xì)胞及具有抗凋亡功能的分泌蛋白。

圖6    T-PVAT 富含褐變脂肪細(xì)胞及抗凋亡分泌蛋白

為了明確 T-PVAT 中發(fā)揮抗凋亡作用的組分，研究人員將其分離為脂肪細(xì)胞和基質(zhì)血管組分（SVF），并收集各自的培養(yǎng)液處理 VSMCs 。如圖7所示，來(lái)自 T-PVAT 脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)液能顯著抑制 H₂O₂或 TNFα 聯(lián)合 CHX 誘導(dǎo)的 VSMC 凋亡（表現(xiàn)為 cleaved-Parp、cleaved-Caspase-3 表達(dá)降低，膜聯(lián)蛋白 V 陽(yáng)性凋亡細(xì)胞減少），且效果優(yōu)于 A-PVAT 脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)液，而 T-PVAT 與 A-PVAT 的 SVF 培養(yǎng)液在抗凋亡作用上無(wú)差異。這表明，T-PVAT 的抗凋亡作用主要通過(guò)其脂肪細(xì)胞分泌的物質(zhì)實(shí)現(xiàn)。

圖7   從 T-PVAT 中分離的脂肪細(xì)胞分泌組可抑制 VSMC 凋亡

最后，為了找出介導(dǎo) T-PVAT 抗凋亡作用的關(guān)鍵因子，研究通過(guò)整合 RNA 測(cè)序與質(zhì)譜數(shù)據(jù)，篩選出軟骨寡聚基質(zhì)蛋白（COMP），認(rèn)為其是 T-PVAT 中富集的分泌型抗凋亡蛋白（圖 8a）。蛋白質(zhì)印跡分析顯示，T-PVAT 脂肪細(xì)胞的裂解物及培養(yǎng)液中 COMP 表達(dá)量顯著高于 A-PVAT 脂肪細(xì)胞（圖 8b ）。免疫組織化學(xué)染色也證實(shí) T-PVAT 中 COMP 表達(dá)顯著高于 A-PVAT（圖 8c），這些結(jié)果支持 COMP 可能是 T-PVAT 發(fā)揮抗凋亡作用的關(guān)鍵分泌蛋白。對(duì) COMP 對(duì)VSMCs 的抗凋亡作用進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組 COMP 蛋白處理能顯著抑制 TNFα 聯(lián)合 CHX 誘導(dǎo)的 VSMC 凋亡（圖 8d、e ），降低 cleaved-Parp、cleaved-Caspase-3 的表達(dá)（圖 8f–h）。進(jìn)一步檢測(cè)抗凋亡蛋白發(fā)現(xiàn)，COMP 可顯著提高 VSMCs 中 survivin 的蛋白水平，但對(duì) Bcl-2 無(wú)影響（圖8f、i、j ），這表明 COMP 的抗凋亡作用可能通過(guò) survivin 介導(dǎo)。

圖8    T-PVAT分泌的 COMP 可抑制 VSMC 凋亡

總之，該研究表明，T-PVAT 較 A-PVAT 更接近棕色脂肪表型，其移植可通過(guò)旁分泌或內(nèi)分泌作用抑制血管平滑肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制腹主動(dòng)脈瘤的形成。該發(fā)現(xiàn)為腹主動(dòng)脈瘤的治療提供了新的潛在治療方向。

參考文獻(xiàn)：Huang CL, Huang YN, Yao L, Li JP, Zhang ZH, Huang ZQ, Chen SX, Zhang YL, Wang JF, Chen YX, Liu ZY. Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes. Acta Pharmacol Sin. 2023 Feb;44(2):345-355. doi: 10.1038/s41401-022-00959-7. Epub 2022 Aug 9. PMID: 35945313; PMCID: PMC9889802.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35945313/

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