小鼠模型在靶向HPCS細(xì)胞發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用，有望破解耐藥與復(fù)發(fā)難題

1月22日，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)顏彥教授團(tuán)隊聯(lián)合美國紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心Tuomas Tammela教授團(tuán)隊，在國際知名期刊Nature發(fā)表題為“Critical role for a high-plasticity cell state in lung cancer”的重磅研究成果。

該研究通過一套高精度小鼠遺傳報告系統(tǒng)，首次證實(shí)并定位肺癌中一類具有“高可塑性細(xì)胞狀態(tài)（HPCS）”的特殊腫瘤細(xì)胞。它們連接并調(diào)控著不同細(xì)胞狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換，驅(qū)動肺癌進(jìn)展、促進(jìn)細(xì)胞多樣性并導(dǎo)致治療耐受。這項研究為理解癌癥可塑性的組織提供了新理論框架，也為開發(fā)靶向腫瘤細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換的新型治療策略奠定了基礎(chǔ)。

南模生物為該研究提供了Slc4a11-FSF-MCD，Hopx-FSF-MACD以及Hipp11-FSF-GGCB三個小鼠模型。

1 HPCS細(xì)胞的追蹤與耗竭工具鼠
肺腺癌（LUAD）是一種常見、難治且致死率高的實(shí)體腫瘤。KP小鼠模型通過在肺上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)或利用病毒表達(dá)Cre重組酶，激活KrasG12D突變并失活p53，使小鼠自發(fā)肺腺癌。該模型能夠精準(zhǔn)模擬人類LUAD的發(fā)生發(fā)展過程，重現(xiàn)其關(guān)鍵分子事件及組織病理特征。

研究者利用scRNA-seq構(gòu)建KP小鼠肺腺癌演化圖譜，發(fā)現(xiàn)一種持續(xù)存在于腫瘤早期及全程的高可塑性細(xì)胞狀態(tài)（HPCS），這類細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征呈現(xiàn)同時啟動與多種細(xì)胞身份相關(guān)的基因程序的特點(diǎn)，并且在癌細(xì)胞的演化圖譜中腫瘤進(jìn)展關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點(diǎn)。

通過篩選，研究者發(fā)現(xiàn)Slc4a11是KP LUAD模型中HPCS細(xì)胞的特異性標(biāo)志物（圖1a）。借此標(biāo)志物，研究者構(gòu)建了一整套報告系統(tǒng)，用于對HPCS細(xì)胞進(jìn)行可視化、分離、譜系示蹤和耗竭。

首先，研究者將帶有frt-Stop-frt位點(diǎn)、mScarlet紅色熒光蛋白、他莫昔芬誘導(dǎo)型Cre重組酶（creERT2）及人白喉毒素受體（DTR）的MCD報告盒敲入Slc4a11基因之后，構(gòu)建了Slc4a11-FSF-MCD小鼠。

其次，研究者進(jìn)一步構(gòu)建了Hipp11-FSF-GGCB小鼠。Hipp11基因是小鼠的普遍表達(dá)位點(diǎn)，研究者在Hipp11后連接了frt-Stop-frt位點(diǎn)、海腎熒光素酶（G-Luc）與eGFP融合報告基因（簡稱GG），海樽熒光素酶（C-Luc）與TagBFP融合報告基因（簡稱CB），并且GC序列兩端存在loxp位點(diǎn)，可受到Cre重組酶的調(diào)控（圖1c）。

研究者將Slc4a11-FSF-MCD、Hipp11-FSF-GGCB與KPfrt小鼠進(jìn)行交配，獲得KPfrt;Slc4a11^MCD/+;Hipp11^GGCB/+小鼠，并使用氣管滴注Flp病毒誘導(dǎo)KP小鼠肺腺癌形成（圖1c,d）。肺癌組織被eGFP標(biāo)記，Slc4a11陽性的HPCS細(xì)胞被mScarlet標(biāo)記。在腫瘤誘導(dǎo)后15-16周，原位肺腫瘤中mScarlet陽性細(xì)胞占eGFP陽性癌細(xì)胞總數(shù)的平均比例為17.0±4.3%，這一比例與單細(xì)胞RNA測序檢測到的HPCS細(xì)胞比例（13.1±1.6%）高度吻合。組織切片空間分析顯示，mScarlet陽性細(xì)胞在腫瘤組織中呈小簇狀或單細(xì)胞狀分布（圖1f）。mScarlet陽性細(xì)胞在腫瘤組織中與另一HPCS細(xì)胞的標(biāo)志物integrin α2的表達(dá)也接近一致（圖1e，g），由此可得，Slc4a11^MCD/+可作為HPCS細(xì)胞特異性報告系統(tǒng)。
 

Fig1. The Slc4a11^MCD/+ reporter system marks the HPCS in vivo.

2 HPCS 是細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換的樞紐
肺癌進(jìn)展的核心特征之一是肺上皮細(xì)胞身份的喪失，表現(xiàn)為肺上皮關(guān)鍵調(diào)控因子NKX2.1的下調(diào)與胚胎期轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Hmga2的表達(dá)。而研究者發(fā)現(xiàn)，隨著病程加劇，KPfrt;Slc4a11^MCD/+小鼠的肺癌組織中HPCS的密度升高（圖1h），并且 HPCS中的NKX2.1表達(dá)減少，HMGA2表達(dá)增加。隨著相關(guān)證據(jù)提出，研究者懷疑HPCS可能在早期腫瘤病變中的肺泡狀態(tài)與肺癌進(jìn)展后期出現(xiàn)的細(xì)胞狀態(tài)之間起著關(guān)鍵的過渡作用。

為探究HPCS在腫瘤微環(huán)境中的轉(zhuǎn)換潛能，研究者進(jìn)一步開發(fā)了一套針對HPCS細(xì)胞的譜系追蹤系統(tǒng)，將KPfrt;Slc4a11^MCD/+小鼠與報告基因工具鼠Rosa26^mTmG/+小鼠交配。該小鼠的全身細(xì)胞可表達(dá) tdTomato熒光蛋白，而當(dāng)使用TAM誘導(dǎo)Cre活性后，在TAM代謝期（給藥后三天）的HPCS細(xì)胞將表達(dá)GFP 熒光蛋白。這部分GFP陽性細(xì)胞將被認(rèn)為是示蹤細(xì)胞。

在給藥14天后，對早期（6周）和晚期（12周）腫瘤中分選出的示蹤細(xì)胞（GFP陽性）進(jìn)行scRNA-seq分析顯示，仍處于HPCS狀態(tài)（mScarlet陽性）的示蹤細(xì)胞比例相較于第3天基線水平急劇下降，表明大多數(shù)被示蹤細(xì)胞在14天內(nèi)已不再是HPCS并獲得了新的細(xì)胞命運(yùn)（圖2c–f）。衡量細(xì)胞群體內(nèi)細(xì)胞表型多樣性的定量指標(biāo)——表型體積同樣說明了這一問題（圖2g–h）。

為了對比HPCS與AT1樣細(xì)胞的可塑性，研究者也在AT1細(xì)胞標(biāo)志物Hopx基因后敲入了FSF-mScarlet-AkaLuc-CreER-DTR（簡稱FSF-MACD），并構(gòu)建了KPfrt;Hopx^MACD/+;Rosa26^mTmG/+小鼠。經(jīng)過與上述一致的TAM誘導(dǎo)示蹤后，針對示蹤的AT1樣細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq分析顯示。結(jié)果表明，在晚期（12周）腫瘤中分選出的示蹤AT1樣細(xì)胞內(nèi)始終維持在AT1樣狀態(tài)，且被示蹤細(xì)胞的表型體積實(shí)際上發(fā)生了收縮（圖2i–k）。這說明僅有HPCS具有高度可塑性，而且會由HPCS產(chǎn)生具有固定表型和低可塑性的癌細(xì)胞狀態(tài)，例如AT1樣狀態(tài)。
 

Fig2. The HPCS is a hub for cell state transitions in vivo.

3 非HPCS細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為HPCS狀態(tài)
在KPfrt;Slc4a11^MCD/+;Rosa26^mTmG/+小鼠的示蹤實(shí)驗中，研究者發(fā)現(xiàn)一個獨(dú)特的現(xiàn)象：被示蹤的HPCS細(xì)胞（GFP陽性）會快速退出HPCS狀態(tài)，而腫瘤中HPCS細(xì)胞（mScarlet陽性）的相對比例卻保持穩(wěn)定。這表明，非HPCS細(xì)胞可能具有獲得HPCS狀態(tài)的能力。

為此，研究者將KPfrt;Slc4a11^MCD/+;Hipp11^GGCB/+小鼠中的原代非HPCS細(xì)胞（mScarlet⁻GFP⁺細(xì)胞）接種到普通小鼠的肺部；同時以純化的HPCS細(xì)胞（mScarlet⁺GFP⁺）作為對照進(jìn)行移植。值得注意的是，由非HPCS細(xì)胞群體產(chǎn)生的腫瘤中，mScarlet陽性細(xì)胞的比例與原親本腫瘤相似（圖2l,m），表明非HPCS細(xì)胞能夠獲得HPCS狀態(tài)。

綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明，HPCS并非一種只能通過預(yù)先存在的HPCS細(xì)胞自我更新產(chǎn)生的干細(xì)胞樣狀態(tài)，而是能夠在非HPCS狀態(tài)之間動態(tài)互變。

4 HPCS 會促進(jìn)腫瘤的生長和進(jìn)展
為了探究HPCS在腫瘤微環(huán)境中的生長潛能，研究者構(gòu)建了標(biāo)記HPCS細(xì)胞的KPfrt;Slc4a11^MCD/+;Hipp11^GGCB/+ 小鼠；隨機(jī)標(biāo)記部分癌細(xì)胞的KPfrt;Rosa26^{FSF-CreERT2/+};Hipp11^GGCB/+小鼠；標(biāo)記AT1樣細(xì)胞的KPfrt;Hopx^MACD/+;Hipp11^GGCB/+小鼠。這三類小鼠的Hipp11^GGCB/+報告基因在正常情況下表達(dá)G-Luc與eGFP融合報告基因（簡稱GG），而當(dāng)使用TAM誘導(dǎo)Cre活性后會表達(dá)C-Luc與TagBFP融合報告基因（簡稱CB）（圖3a,b）。在腫瘤誘導(dǎo)后14-16周的已建立LUAD中，通過C-Luc/G-Luc進(jìn)行縱向譜系示蹤發(fā)現(xiàn)，源自HPCS的癌細(xì)胞相較于隨機(jī)標(biāo)記的癌細(xì)胞具有顯著更高的生長潛能和克隆擴(kuò)增能力，而分化型AT1樣細(xì)胞的生長潛能較低（圖3c）。

盡管HPCS具有高生長潛能，但研究者發(fā)現(xiàn)HPCS本身高度靜息。在KPfrt;Slc4a11^MCD/+;Rosa26^mTmG/+小鼠中，由HPCS分化而來并退出HPCS狀態(tài)的LUAD細(xì)胞在示蹤后第3天就顯示出高增殖能力，并在第14天進(jìn)一步升高，而非HPCS衍生物的增殖率保持恒定（圖3e）。這些數(shù)據(jù)表明，雖然HPCS整體處于靜息狀態(tài)，但其部分衍生物在退出HPCS后迅速進(jìn)入細(xì)胞周期，驅(qū)動HPCS來源的癌細(xì)胞發(fā)生克隆擴(kuò)增，并推動腫瘤生長。

由于HPCS在腫瘤發(fā)生早期出現(xiàn)并產(chǎn)生進(jìn)展期細(xì)胞狀態(tài)，研究者認(rèn)為其在早期腫瘤進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用。因此，研究者在腫瘤誘導(dǎo)后第1周開始至第7周，通過連續(xù)全身性給予白喉毒素（DT），將KPfrt;Slc4a11^MCD/+;Hipp11^GGCB/+小鼠中的HPCS進(jìn)行細(xì)胞剃除。結(jié)果表明，DT組的總腫瘤負(fù)荷顯著降低，未出現(xiàn)大尺寸（>0.15 mm²）的腫瘤病變（圖3h）。HPCS的細(xì)胞剃除抑制了具有高增殖率或表達(dá)HNF4^α的兼具肺和胃樣特征的混合細(xì)胞狀態(tài)的出現(xiàn)（圖3i-j），這些結(jié)果表明，HPCS對于增生性病變的起始并非必需，但對于這些腫瘤的進(jìn)展至關(guān)重要。

研究者進(jìn)一步在體外構(gòu)建了KP;Slc4a11^MACD/+LUAD細(xì)胞系，并將其接種至NSG小鼠上，與原發(fā)腫瘤中的情況一致，在該模型的皮下同種移植瘤中HPCS的耗竭產(chǎn)生了顯著的抗腫瘤效應(yīng)（圖3m）。綜上所述，這些結(jié)果表明HPCS對于早期肺腫瘤的進(jìn)展至關(guān)重要。
 

Fig3. The HPCS drives tumour growth.

5 耐藥性起源于HPCS
研究者繼續(xù)在KPfrt;Slc4a11^MCD/+;Hipp11^GGCB/+小鼠中進(jìn)行兩種給藥測試（順鉑化療與靶向KRAS(G12D)的MRTX1133），探究HPCS是否產(chǎn)生治療抵抗?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞類型（圖4a）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療反應(yīng)主要清除非HPCS來源的細(xì)胞，而HPCS來源的細(xì)胞顯著富集（圖4b）。

研究者進(jìn)一步分析了治療3周后KPfrt;Slc4a11^MCD/+;Hipp11^GGCB/+小鼠腫瘤中被示蹤的HPCS來源細(xì)胞的命運(yùn)。兩種治療手段都降低了被示蹤細(xì)胞的表型體積（圖4c），表明治療引導(dǎo)HPCS向更少的狀態(tài)分化。兩種治療均降低了被示蹤細(xì)胞池和總細(xì)胞池中仍處于HPCS狀態(tài)的細(xì)胞比例（圖4d），表明HPCS本身并不耐藥，但它產(chǎn)生了由耐藥狀態(tài)組成的微小殘留病灶MRD。將DT介導(dǎo)的HPCS消融與順鉑或MRTX1133聯(lián)合使用，實(shí)現(xiàn)了近乎完全的腫瘤根除（圖4e-g）。

同時，研究者發(fā)現(xiàn)Plaur（編碼uPAR）在HPCS中顯著富集。研究者在接腫了KP;Slc4a11^MACD/+LUAD細(xì)胞系的皮下同種移植瘤模型中測試了靶向uPAR的CAR T療法，產(chǎn)生了強(qiáng)烈的抗腫瘤反應(yīng)，表現(xiàn)為Slc4a11-AkaLuc信號消失和腫瘤生長延緩（圖4i–k）。

綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明HPCS是一種關(guān)鍵的、可靶向治療的癌細(xì)胞狀態(tài)，驅(qū)動著腫瘤進(jìn)展、異質(zhì)性和治療抵抗。

Fig4. Drug-resistant cell states originate from the HPCS.

6 HPCS在多種癌種與其他多種組織的再生上皮中反復(fù)出現(xiàn)
鑒于HPCS在LUAD中的關(guān)鍵作用，研究者推測HPCS可能反映了多種癌癥中共有的關(guān)鍵癌細(xì)胞狀態(tài)。研究者在結(jié)直腸癌、頭頸癌、肺腺癌、卵巢癌、胰腺導(dǎo)管腺癌、前列腺腺癌和皮膚鱗狀細(xì)胞癌的單細(xì)胞數(shù)據(jù)集中均確認(rèn)了HPCS特征的存在（圖5a）。在人類LUAD組織中，SLC4A11、PLAUR、HPCS特征與應(yīng)激程序同樣相關(guān)（圖5b）。而這一相關(guān)性同樣出現(xiàn)在小鼠的肺損傷后肺泡、胰腺、腸道和皮膚的損傷相關(guān)再生上皮中（圖5c-d），這一發(fā)現(xiàn)提示腫瘤可能通過“劫持”機(jī)體固有的再生與修復(fù)程序，獲得持續(xù)進(jìn)行細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換的能力，從而在治療壓力下不斷“進(jìn)化升級”，獲得長期生存優(yōu)勢。
 

Fig5. An HPCS-like state marked by Slc4a11 and Plaur is ubiquitously present in multiple carcinomas and regenerating epithelia.

這項研究將腫瘤異質(zhì)性與細(xì)胞可塑性的理論假設(shè)，從概念推向了實(shí)驗驗證，并鎖定為一個可干預(yù)的靶點(diǎn)。它提示我們，未來的抗癌策略或許不僅要?dú)灉缒[瘤的“主力部隊”，更需精準(zhǔn)識別并清除那些驅(qū)動演化與耐藥的核心“變形軍團(tuán)”。靶向HPCS有望成為與現(xiàn)有療法協(xié)同作戰(zhàn)的“組合拳”，通過提前鏟除耐藥種子，最大化化療與靶向治療的持久性和徹底性，甚至為高危人群的癌癥預(yù)防提供新思路。

關(guān)于我們
上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，簡稱"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科創(chuàng)板上市高科技生物公司（股票代碼：688265），始終以編輯基因、解碼生命為己任，專注于模式生物領(lǐng)域，打造了以基因修飾動物模型研發(fā)為核心，涵蓋多物種模型構(gòu)建、飼養(yǎng)繁育、表型分析、藥物臨床前評價等多個技術(shù)平臺，致力于為全球高校、科研院所、制藥企業(yè)等客戶提供全方位、一體化的基因修飾動物模型產(chǎn)品解決方案。