Pipetty電動(dòng)移液器在馬流感HI實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

方案摘要：本方案結(jié)合Pipetty電動(dòng)移液器精準(zhǔn)控量、連續(xù)移液、操作穩(wěn)定、防交叉污染的核心優(yōu)勢，規(guī)范馬流感HI（血凝抑制）實(shí)驗(yàn)中樣品處理、抗原稀釋、反應(yīng)體系配制等關(guān)鍵操作環(huán)節(jié)，有效規(guī)避手動(dòng)移液易出現(xiàn)的移液誤差、操作效率低下、樣品交叉污染等問題。充分發(fā)揮該移液器移液精準(zhǔn)度高、重復(fù)性強(qiáng)、操作便捷的特點(diǎn)，保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、一致性和可靠性，為馬流感的快速、精準(zhǔn)檢測提供標(biāo)準(zhǔn)化操作依據(jù)。適用于動(dòng)物疫病防控機(jī)構(gòu)、獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室等開展馬流感血清抗體檢測工作，助力提升檢測工作的效率與質(zhì)量。
 
方案詳情：
一、實(shí)驗(yàn)原理
馬流感病毒（EIV，主要為H3N8亞型）表面含有血凝素，可與雞紅細(xì)胞表面的受體結(jié)合，使雞紅細(xì)胞發(fā)生凝集。當(dāng)存在馬流感特異性抗體時(shí)，抗體可與病毒HA結(jié)合，阻止HA與雞紅細(xì)胞受體的結(jié)合，從而抑制紅細(xì)胞凝集。通過倍比稀釋血清，測定能完全抑制4個(gè)HA單位病毒凝集的血清最高稀釋倍數(shù)，即為該血清的HI抗體效價(jià)，以此判斷樣品中馬流感抗體的存在及含量，為馬流感感染診斷提供依據(jù)。
 
二、‌實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1、設(shè)配和材料
① Pipetty電動(dòng)移液器MSIC01-03-20、MSIC01-03-250、MSIC01-03-1000；
② 離心機(jī)；
③ 振蕩器。
 
2、試劑和材料
① 96孔V型或U型微量反應(yīng)板；
② PBS；
③ 1%雞紅細(xì)胞懸液；
④ H3N8亞型EIV滅活抗原；
⑤ H3N8亞型EIV陽性血清和陰性血清(商品化試劑)。
 
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟
1、用Pipetty電動(dòng)移液器吸取150μL待檢血清，加入無菌微量離心管中。更換吸頭，吸取300μL新配制的0.016mol/L過碘酸鉀溶液，加入血清中，自動(dòng)混勻模式，混勻，置于22℃±2℃環(huán)境中作用15min。再次吸取150μL 3%甘油PBS，加入離心管中，混勻后繼續(xù)置于22℃±2℃環(huán)境中作用15min，中和過剩的過碘酸鉀。將離心管放入恒溫水浴鍋，56℃水浴滅活30min，滅活后取出，冷卻至室溫，備用。
2、對H3N8亞型EIV滅活抗原進(jìn)行HA效價(jià)檢測。
3、稀釋抗原，使含量為4個(gè)HA單位(4×HA最小凝集量)。
4、使用Pipetty電動(dòng)移液器，設(shè)置連續(xù)分液模式，吸取25μL PBS緩沖液，加入96孔微量反應(yīng)板各孔中。
 
5、連續(xù)分液模式，吸取25μL預(yù)處理后的待檢血清、陽性對照血清、陰性對照血清，分別加入反應(yīng)板每行的第1孔中，更換吸頭，進(jìn)入混勻模式，用移液器吹吸5次混勻，然后單次吸取25μL轉(zhuǎn)移至第2孔，混勻，依次倍比稀釋至第11孔，第11孔混勻后吸取25μL棄去；第12孔不加血清，僅加PBS和抗原，作為空白對照。
6、連續(xù)分液模式，吸取25μL 4個(gè)HA單位的抗原，加入反應(yīng)板每孔中，輕輕振蕩混勻，置于22℃±2℃環(huán)境中孵育30min。
 
7、用Pipetty連續(xù)分液模式吸取50μL 1%雞紅細(xì)胞懸液，加入反應(yīng)板每孔中，輕輕振蕩混勻，置于22℃±2℃環(huán)境中孵育30min；
8、將反應(yīng)板傾斜45°角，保持20-30s，觀察雞紅細(xì)胞凝集抑制情況。
9、觀察反應(yīng)板各孔，若沉淀的雞紅細(xì)胞向下滑動(dòng)，呈流線狀，無紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象，說明HA反應(yīng)被完全抑制，以能完全抑制4個(gè)HA單位抗原的血清最高稀釋倍數(shù)，作為該血清的HI抗體效價(jià)。
 
四、結(jié)果判定
1、結(jié)果成立條件
陽性對照血清的HI效價(jià)與已知效價(jià)相差不超過1個(gè)滴度;陰性對照血清HI效價(jià)小于1:8。
2、陽性
HI效價(jià)不低于1:8,判定為EIV抗體陽性。
3、陰性
HI效價(jià)小于1:8,判定為EIV抗體陰性。