Hawk原位蛋白相互作用功能定量分析平臺聯(lián)合CyTOF助力腫瘤免疫研究

在腫瘤研究領(lǐng)域中，頂尖學者所選的技術(shù)路線設(shè)備選擇往往指引著技術(shù)突破方向。近日，美國科學促進會（The American Association for the Advancement of Science，AAAS，全球最具影響力的綜合性科學組織之一，雜志Science隸屬于該學會）會士、日本國立癌癥中心研究所癌癥免疫學部門主任，同時擔任名古屋大學研究生院醫(yī)學系免疫學系教授的西川博嘉教授，正式購入HAWK原位蛋白相互作用功能定量分析系統(tǒng)，聯(lián)用CyTOF（質(zhì)譜流式細胞術(shù)）設(shè)備，用于腫瘤免疫調(diào)控的機制研究。
   
西川教授是腫瘤免疫治療領(lǐng)域知名專家，致力于CD4+調(diào)節(jié)性T（Treg）細胞在內(nèi)的免疫抑制網(wǎng)絡(luò)抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答的相關(guān)機制研究。他發(fā)現(xiàn)效應(yīng)T細胞的關(guān)鍵抗腫瘤表型會受Treg細胞以“抗原依賴性”調(diào)控，對自身免疫、過敏、感染及移植等多領(lǐng)域的免疫應(yīng)答機制研究具有指導(dǎo)意義。

該團隊的核心探索圍繞“免疫表型與功能的深度關(guān)聯(lián)”展開，而CyTOF設(shè)備雖能實現(xiàn)單細胞高通量表型分型，精準捕獲Treg與效應(yīng)T細胞的表型差異。針對“表型背后的功能調(diào)控機制”、“基因組異常對免疫功能的影響路徑”等需要精準的功能解析，采用Hawk原位蛋白相互作用功能分析平臺，基于CyTOF獲取的大量數(shù)據(jù)進一步定量驗證，形成功能互補的聯(lián)用體系，如下是相關(guān)技術(shù)路線。

第一步
樣本準備
以小鼠為例，選取荷瘤小鼠腫瘤組織或臨床患者腫瘤穿刺樣本，一部分樣本制成單細胞懸液，用于CyTOF表型分析；另一部分樣本制成組織切片，用于HAWK原位蛋白相互作用功能檢測。

第二步
CyTOF高通量單細胞表型分型，鎖定關(guān)鍵細胞亞群
與光譜流式細胞術(shù)不同，CyTOF利用金屬同位素作為標記單元，可有效避免串色，實現(xiàn)數(shù)十乃至上百種細胞標志物的同時檢測。因此，CyTOF能從復(fù)雜的細胞群體中，完成海量靶標的精準初篩——快速區(qū)分不同功能狀態(tài)的細胞亞群，鎖定與研究目標直接相關(guān)的核心細胞群體，同時捕捉癌細胞基因組異常所關(guān)聯(lián)的表型特征。繼而借助數(shù)據(jù)分析，高效定位關(guān)鍵研究對象，比如藥物處理后表型發(fā)生顯著變化的特定細胞亞群，為后續(xù)功能解析明確方向，徹底擺脫傳統(tǒng)研究中“大海撈針”式的細胞篩選困境，大幅提升研究效率（圖2）。
   
第三步
HAWK深度解析，定量分析和驗證目標細胞標志物
面對CyTOF初篩出的核心細胞群體，HAWK核心技術(shù)QF-Pro的整體實驗流程與傳統(tǒng)免疫熒光染色十分接近（圖3）。但較于免疫熒光染色較差的分辨率（200nm以上），QF-Pro利用熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）聯(lián)合時間分辨熒光（FLIM），在蛋白相互作用功能分析的分辨率是10nm。即兩種特定熒光基團靠得足夠近（10nm以內(nèi)）時出現(xiàn)FRET現(xiàn)象，導(dǎo)致熒光壽命縮短，熒光壽命的變化被FLIM收集，從而精確驗證目的標志物是否存在真實的相互作用 。因此，HAWK的高分辨率，有效避免了常規(guī)多重熒光及其他技術(shù)單純的空間重疊但無相互作用的假陽性信號問題；同時，熒光壽命縮短是熒光分子的內(nèi)在屬性，不受濃度、酸堿度等外界條件影響，HAWK的精準定量分析更穩(wěn)定、更準確。
 
第四步
數(shù)據(jù)整合
通過生物信息學工具整合CyTOF的“表型數(shù)據(jù)”與HAWK的“功能數(shù)據(jù)”，結(jié)合已有的各種信號通路數(shù)據(jù)庫（pathway分析）和蛋白功能分析數(shù)據(jù)庫（GO分析）等，分析從細胞表型到功能狀態(tài)再到整體調(diào)控機制的一整套結(jié)果。最終從定性和定量的角度研究對特定腫瘤發(fā)生、發(fā)展起關(guān)鍵作用的基因、蛋白和細胞。

從CyTOF與HAWK聯(lián)用的技術(shù)路線看，從大范圍篩選確定目的靶標到深度驗證目的靶標：CyTOF以高通量優(yōu)勢解決“哪些細胞或哪些蛋白是關(guān)鍵研究對象”的問題，快速完成細胞群體的表型分型與篩選；HAWK聚焦“這些關(guān)鍵細胞或蛋白的功能是什么、相互作用機制如何”的核心問題，提供高分辨率的功能解析數(shù)據(jù)。這種聯(lián)用模式，實現(xiàn)了“免疫表型觀察”到“功能機制解析”的研究遞進邏輯，讓復(fù)雜的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究變得更系統(tǒng)、高效。

廠家介紹
HAWK Biosystems位于西班牙，成立于2016年，聚焦空間功能蛋白質(zhì)組學領(lǐng)域。
HAWK超高精度原位蛋白相互作用定量分析系統(tǒng)：
* 核心技術(shù) QF-Pro® ，F(xiàn)RET/FLIM（熒光共振能量轉(zhuǎn)移 / 熒光壽命成像顯微鏡）；
* 10 nm高分辨率，原位量化蛋白相互作用的功能空間圖譜，突破僅能檢測蛋白表達／共定位的局限；
* 特有的信號放大機制有效克服自發(fā)熒光，極大提升信噪比；
* 用于蛋白質(zhì)相互作用、蛋白翻譯后修飾、腫瘤治療有效性評估、腫瘤微環(huán)境信號解析、靶標靶點等定量分析和驗證。 

環(huán)亞生物與 HAWK 的合作關(guān)系
環(huán)亞生物科技有限公司（APG BIO）已正式成為 HAWK Biosystems 在中國地區(qū)的獨家代理商，為國內(nèi)研究者提供Hawk原位蛋白相互作用定量分析系統(tǒng)及服務(wù)的推廣、銷售、應(yīng)用培訓及售后保障等一站式服務(wù)。