PLA檢測(cè)技術(shù)在證明蛋白共定位和互作中的優(yōu)勢(shì)

最近好幾個(gè)客戶(hù)跟我吐槽：文章好不容易送審，審稿人意見(jiàn)回來(lái)了，其他問(wèn)題都好說(shuō)，唯獨(dú)有一條讓人頭大——“請(qǐng)?zhí)峁└�直接的證據(jù)證明這兩個(gè)蛋白存在互作，而非僅僅是共定位。”
更扎心的是，這條意見(jiàn)下面往往還跟著一句：“建議補(bǔ)充PLA實(shí)驗(yàn)。”
如果你也收到過(guò)類(lèi)似的審稿意見(jiàn)，別慌。今天我們就來(lái)聊聊：為什么審稿人越來(lái)越不愛(ài)看Confocal共定位？PLA到底強(qiáng)在哪？

1、Confocal共定位，真的不夠用了！
先問(wèn)一個(gè)扎心的問(wèn)題：你花了大把時(shí)間拍的Confocal共定位圖，真的能證明兩個(gè)蛋白“在一起”嗎？
答案是：不能。
為什么？因?yàn)槲锢順O限決定了Confocal看不那么近。

早在1873年，光學(xué)大佬Ernst Abbe就提出了一個(gè)讓所有顯微鏡學(xué)家“絕望”的理論——衍射極限。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，由于光的衍射特性，光學(xué)顯微鏡能分辨的最小距離被卡在了大約250納米。
250納米是什么概念？

一個(gè)典型的蛋白復(fù)合物，直徑大約是20-50納米。這意味著，在Confocal的鏡頭下，哪怕兩個(gè)蛋白隔著200多納米，它們也會(huì)“糊”在一起，呈現(xiàn)出漂亮的黃色疊加信號(hào)。但這200多納米的空隙里，可以塞下好幾個(gè)其他蛋白。

正如MacDonald等在2015年發(fā)表的《Does Super Resolution Fluorescence Microscopy Obsolete Previous Microscopic Approaches to Protein Co-localization?》指出的：
“Conventional microscopy techniques, namely the confocal microscope or deconvolution processes, are resolution limited, ~250 nm, by the diffraction properties of light... This diffraction limit is appreciably above the size of most multi-protein complexes, which are typically 20–50 nm in diameter.”
簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)就是：傳統(tǒng)Confocal的分辨率，看不清楚蛋白復(fù)合物這個(gè)尺度的東西。
所以，你看到的信號(hào)疊加，很可能只是“它們?cè)谕�一個(gè)街區(qū)”，而不是“它們?cè)谖帐?rdquo;（下圖）。
2、免疫熒光和共定位的“鍋”，不止是分辨率。
除了分辨率的問(wèn)題，Confocal和免疫熒光還有一個(gè)“硬傷” ：Z軸干擾。
哪怕你用的是共聚焦，有針孔能排除一部分雜散光，但當(dāng)你拍一個(gè)有一定厚度的細(xì)胞時(shí)，上下層的信號(hào)仍然可能混進(jìn)來(lái)。更別說(shuō)普通寬場(chǎng)熒光顯微鏡了。
上述引用的文章里有一段形象的描述：
“Light from both above and below the plane of focus is collected. As shown in Figure 1A, this affects image acuity even for small cells such as human platelets...” 圖1. SIM技術(shù)在XY維度提升分辨率，并相較傳統(tǒng)技術(shù)增強(qiáng)對(duì)比度。來(lái)自人血小板的單一圖像平面，分別通過(guò)寬場(chǎng)顯微鏡（A）、反卷積處理后（B）以及3D-SIM顯微鏡（C）觀察。作為分辨率示例，我們通過(guò)共聚焦顯微鏡掃描了細(xì)胞中的微管。  通過(guò) Cy3 熒光（紅色）成像的這些直徑 24 納米的物體，在共聚焦顯微鏡下的表觀 XY 寬度（直徑）為 250 納米，而通過(guò) 3D-SIM 成像則達(dá)到了 100 納米的分辨率，表明其 XY 方向分辨率比共聚焦顯微鏡提高了約 2 倍。
作為分辨率示例，我們通過(guò)共聚焦顯微鏡掃描細(xì)胞中的微管哪怕是小到血小板這種細(xì)胞（厚度約1.5微米），來(lái)自焦平面上方和下方的光線也會(huì)讓圖像變得模糊，讓你難以判斷兩個(gè)蛋白到底是不是真的在同一層。

有人可能會(huì)說(shuō)：那做反卷積（Deconvolution）不就行了？
反卷積確實(shí)能讓圖像變清晰，對(duì)比度提升，但正如文章里提到的：
“Deconvolution algorithms in which the light distribution is corrected on the basis of the point spread functions allow for contrast improvement as shown in Figure 1B, but not a gain in resolution.”
反卷積只能讓圖像更好看，并不能突破250納米的物理極限。
也就是說(shuō)，你花大價(jià)錢(qián)買(mǎi)了高性能共聚焦，又花大量時(shí)間優(yōu)化拍攝參數(shù)、掃層、做3D重構(gòu)，最后得到的依然只是“像素級(jí)”的共定位，而非“分子級(jí)”的互作證據(jù)。

3、有人問(wèn)：Confocal不是已經(jīng)能到100nm了嗎？現(xiàn)在STED超高分辨顯微鏡甚至能到25nm——是不是夠用了？
確實(shí)，隨著科技的進(jìn)步，顯微技術(shù)這些年發(fā)展很快：
超分辨Confocal（如Airyscan）能把XY軸分辨率提升到 90-120 nm，主流的超分辨成像技術(shù)比如結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡技術(shù)（SIM）、單分子定位成像技術(shù)（SMLM）和受激發(fā)射損耗顯微技術(shù)（STED）技術(shù)則更進(jìn)一步，頂尖設(shè)備可達(dá)25 nm（如Abberior Facility Line）。
但問(wèn)題是：用STED做共定位，能替代PLA嗎？
答案是：不能。因?yàn)镾TED是成像技術(shù)，PLA是檢測(cè)技術(shù)，兩者是兩碼事。

STED能讓你看到兩個(gè)熒光點(diǎn)靠得很近，比如拍到30nm。但它需要你自己去判斷：30nm算不算互作？而且STED分不清這兩種情況：兩個(gè)蛋白是在一個(gè)復(fù)合體里，還是兩個(gè)獨(dú)立的復(fù)合體正好靠近。

Naveni^TM PLA的邏輯則不同。它并不讓你去“看”距離，而是直接用化學(xué)反應(yīng)告訴你答案：只有當(dāng)兩個(gè)蛋白的抗體探針能被連接酶連起來(lái)時(shí)，才會(huì)產(chǎn)生一個(gè)亮點(diǎn)。這個(gè)亮點(diǎn)代表它們?cè)诜肿映叨壬咸幱诳山佑|的鄰近狀態(tài)。

所以，STED的25nm是“高度可疑的線索”， PLA信號(hào)則是“直接實(shí)錘”。
并且能拍100 nm的Confocal系統(tǒng)價(jià)格不菲，對(duì)操作者的要求也極高。而PLA用普通熒光顯微鏡就能出結(jié)果，流程跟免疫熒光差不多，門(mén)檻低得多。

但是，如果既想確定分子鄰近，又能精確定位到亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可以將PLA和超高分辨率confocal結(jié)合起來(lái)。

4、那么， PLA到底強(qiáng)在哪里？
Naveni^TM PLA的核心優(yōu)勢(shì)，可以總結(jié)為三點(diǎn)：分辨率、原位性、便利性。

分辨率直接拉到40納米
PLA的原理決定了它的“火眼金睛”。只有當(dāng)兩個(gè)蛋白的距離小于40納米（約等于一個(gè)抗體的長(zhǎng)度），PLA才會(huì)產(chǎn)生一個(gè)明亮的點(diǎn)。
40納米 vs  Confocal的250納米——分辨率直接提升了6倍以上。
這意味著，PLA看到的每一個(gè)點(diǎn)，都代表兩個(gè)蛋白真正“面對(duì)面甚至握上手”了，而不是“隔街相望”。

原位驗(yàn)證，不用破壞細(xì)胞
PLA能在保留細(xì)胞完整結(jié)構(gòu)的前提下，告訴你互作發(fā)生的位置——是細(xì)胞膜？是細(xì)胞核？還是某個(gè)特定的細(xì)胞器？
這個(gè)“原位”信息，是Co-IP給不了的。

操作門(mén)檻低，不挑人
這一點(diǎn)可能最容易被忽略，但對(duì)很多實(shí)驗(yàn)室來(lái)說(shuō)，恰恰是最實(shí)在的。
Confocal要拍出漂亮的共定位圖，尤其是要做Z-stack、3D重構(gòu)，對(duì)儀器的要求高，對(duì)操作者的要求更高。你得會(huì)調(diào)激光、會(huì)設(shè)參數(shù)、會(huì)處理圖像、會(huì)做反卷積……門(mén)檻不低。
而PLA呢？

操作流程跟普通免疫熒光差不多：一抗孵育 → 二抗孵育（帶探針）→ 連接 → 擴(kuò)增 → 拍照
拍照用普通熒光顯微鏡就能看：當(dāng)然，用Confocal拍效果更好，但不是必須的
結(jié)果直觀：有亮點(diǎn)的就是鄰近，沒(méi)亮點(diǎn)的就是不互作，不用算復(fù)雜的皮爾森系數(shù)，結(jié)合co-IP體外驗(yàn)證的結(jié)果，拿數(shù)據(jù)說(shuō)話！

最后，回到開(kāi)頭那個(gè)問(wèn)題：為什么審稿人都在推薦PLA？
因?yàn)镻LA填上了Confocal和Co-IP之間的那個(gè)大坑。Confocal做共定位，哪怕是超分辨Confocal，給你的都是“線索”——你需要自己去推斷兩個(gè)蛋白是不是在互作。而Co-IP給你的生化證據(jù)，又丟掉了空間位置信息，經(jīng)常容易假陰性。PLA恰好彌補(bǔ)了缺點(diǎn)，它既有原位保留的空間信息，又有<40 nm才有信號(hào)”的分子級(jí)證據(jù)。

現(xiàn)在頂刊的趨勢(shì)很明確：共定位圖只能作為“全景圖”，PLA才是“特寫(xiě)實(shí)錘”。如果你只給Confocal共定位，審稿人一定會(huì)問(wèn)：“你怎么證明這是互作，而不是偶然靠近？”如果你能給出一張PLA圖，上面一個(gè)個(gè)明亮的點(diǎn)，就是互作發(fā)生的位置和數(shù)量——這個(gè)問(wèn)題就不需要再回答了。

更重要的是，PLA可以在組織切片上做，這是Co-IP做不到的。對(duì)于那些無(wú)法裂解的珍貴樣本，PLA幾乎是唯一的選擇。

如果你不想等到修回時(shí)被要求補(bǔ)實(shí)驗(yàn)、重拍圖、重新分析數(shù)據(jù)，最好的辦法就是：投稿前，先備好PLA。畢竟，審稿人的時(shí)間寶貴，你的時(shí)間更寶貴。