ArrayJet微陣列生物芯片點(diǎn)樣儀助力鑒定黑色素瘤免疫治療預(yù)測(cè)標(biāo)志物

黑色素瘤是一種極具侵襲性的腫瘤，起源于黑色素細(xì)胞，分為皮膚型、肢端型和黏膜型等亞型。免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs，以單克隆抗體為主的抗癌藥物），可顯著改善黑色素瘤晚期患者的預(yù)后。更有多項(xiàng)臨床研究表明，通過聯(lián)用靶向腫瘤血管新生過程的抗血管生成治療，可將客觀緩解率從0%至23.3%提高至 45% 至 48.3%。然而，一部分黑色素瘤患者對(duì)該治療仍無響應(yīng)，需要尋找其他有效的生物標(biāo)志物以優(yōu)化患者分層并降低ICIs相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)。

細(xì)胞外囊泡（EVs）是由原始細(xì)胞分泌的小型膜結(jié)構(gòu)（直徑 30-1000 納米）。它們攜帶生物活性分子，經(jīng)體液在局部擴(kuò)散或遠(yuǎn)距離傳播，由蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用與靶細(xì)胞結(jié)合，從而影響腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移。對(duì)于黏膜型黑色素瘤，其細(xì)胞外囊泡的蛋白質(zhì)譜及與免疫治療的關(guān)聯(lián)目前尚未明確。
文章題目為“Dynamic Change of PD-L2 on Circulating Plasma Extracellular Vesicles as a Predictor of Treatment Response in Melanoma Patients Receiving Anti-PD-1 Therapy”于2025年2月發(fā)表在Journal of Extracellular Vesicles雜志（IF：16.7），作者來自于北京大學(xué)腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)化研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

作者以32例黏膜型黑色素瘤晚期患者為發(fā)現(xiàn)隊(duì)列，接受抗PD-1抑制劑特瑞普利單抗聯(lián)合抗血管生成抑制劑沃利替尼治療，收集治療前的30份血漿樣本和治療4周后的29份血漿樣本，用于篩選潛在生物標(biāo)志物、構(gòu)建預(yù)測(cè)模型，以及評(píng)估疾病預(yù)后、治療療效等相關(guān)指標(biāo)。同時(shí)，68例黑色素瘤其他不同亞型的同期患者為驗(yàn)證隊(duì)列，接受抗PD-1單藥治療，收集治療前的68份血漿樣本和治療后的67份血漿樣本，用于驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中篩選出的標(biāo)志物 / 構(gòu)建的模型是否具有穩(wěn)定的預(yù)測(cè)效能，評(píng)估其準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

通過英國ArrayJet微陣列生物芯片點(diǎn)樣儀，作者將45種蛋白抗體點(diǎn)印于三維修飾的玻片表面，制備成檢測(cè)EVs的蛋白芯片。采用尺寸排阻色譜法（SEC）純化血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中的 EVs。隨后，用含5%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸鹽緩沖液（PBS）封閉芯片1小時(shí)，繼而加入10 μL 經(jīng) 0.05% PBST按 1:10 稀釋的EV樣本，孵育過夜。結(jié)束后，對(duì)蛋白芯片進(jìn)行洗滌，依次加入生物素標(biāo)記的EV抗體、Cy3 標(biāo)記的鏈霉親和素進(jìn)行蛋白芯片雜交反應(yīng)。最后采用熒光生物芯片掃描儀獲取熒光信號(hào)和數(shù)據(jù)分析（研究流程如下圖1）。
 
蛋白芯片結(jié)果顯示：在治療前（基線狀態(tài)），無論治療應(yīng)答情況如何，患者間的細(xì)胞外囊泡（EV）膜蛋白表達(dá)水平存在顯著差異，部分患者呈現(xiàn)高表達(dá)特征（圖 2a）。治療后，細(xì)胞外囊泡的膜蛋白表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)（圖 2b、c）。上述結(jié)果提示膜蛋白表達(dá)水平變化與接受抗 PD-1 聯(lián)合抗血管生成治療的療效具有相關(guān)性。

為分析血漿細(xì)胞外囊泡蛋白與臨床應(yīng)答的關(guān)系，研究人員將患者分為臨床受益組與臨床非受益組。其中，最佳治療應(yīng)答為部分緩解（PR）或疾病穩(wěn)定（SD）的患者歸入臨床受益組，最佳治療應(yīng)答為疾病進(jìn)展（PD）的患者歸入臨床非受益組。按不同時(shí)間點(diǎn)，對(duì)比了兩組患者基線至治療后蛋白表達(dá)水平的變化幅度，各時(shí)間點(diǎn)排名前十的差異蛋白詳見（圖2d）。

基線時(shí)，臨床受益組患者血漿細(xì)胞外囊泡上的TIGIT與PD-L2 蛋白表達(dá)水平顯著低于臨床非受益組。治療4周后，臨床受益組患者細(xì)胞外囊泡上的HLA-ABC、CD39 及 HSP70 蛋白表達(dá)水平顯著高于臨床非受益組，且前者的細(xì)胞外囊泡 PD-L1 蛋白表達(dá)水平在數(shù)值上亦更高。因此，細(xì)胞外囊泡上的TIGIT、PD-L2、HLA-ABC、CD39、PD-L1 及 CD226 蛋白，均與黏膜黑色素瘤患者接受抗 PD-1 聯(lián)合抗血管生成治療的臨床應(yīng)答具有相關(guān)性。  
最后，作者分析了血漿細(xì)胞外囊泡表面 PD-L1 與 PD-L2 的表達(dá)水平，和患者無進(jìn)展生存期及總生存期的關(guān)聯(lián)性。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外囊泡 PD-L1 的倍數(shù)變化值 FC≥1（治療后表達(dá)水平與基線表達(dá)水平的比值≥1，反映蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)） 組與 FC<1 組患者，在無進(jìn)展生存期和總生存期上均無顯著差異。但細(xì)胞外囊泡 PD-L2 的 FC≥1 組患者，無進(jìn)展生存期較 FC<1 組顯著延長(zhǎng)，同時(shí)，F(xiàn)C≥1 組患者的總生存期也長(zhǎng)于 FC<1 組。這是由于治療誘導(dǎo)腫瘤微環(huán)境免疫活化，EV 分泌 PD-L2 代償性上調(diào)導(dǎo)致的。

結(jié)論和意義：PD-L2+EVs 通過抑制 CD8 T 細(xì)胞活化、促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，揭示了 PD-L2+EVs 存在時(shí)腫瘤對(duì)抗 PD-1 治療更敏感的獨(dú)特現(xiàn)象，確定了循環(huán)EV膜上 PD-L2 的動(dòng)態(tài)變化可作為黑色素瘤患者基于 ICIs 治療（包括抗 PD-1 聯(lián)合抗血管生成治療、抗 PD-1 單藥治療）反應(yīng)和生存的潛在篩選生物標(biāo)志物，有助于篩選出最可能從 ICIs 治療中獲益的患者，優(yōu)化治療決策，減少無效治療和治療相關(guān)不良事件的發(fā)生，為黑色素瘤的精準(zhǔn)免疫治療提供了重要的臨床參考依據(jù)。

原文鏈接：https://doi.org/10.1002/jev2.70054

ArrayJet位于英國愛丁堡，專注于提供生物芯片應(yīng)用領(lǐng)域的解決方案及服務(wù)，致力于開發(fā)新型生物樣品噴點(diǎn)方案–噴墨式液體處理平臺(tái)，目前用戶遍布全球27個(gè)國家。

Mercury系列皮升、納升級(jí)微陣列生物芯片點(diǎn)樣儀，采用獨(dú)特的飛行噴墨點(diǎn)樣技術(shù)，實(shí)現(xiàn)行業(yè)第一的快速、非接觸式超微量液體噴點(diǎn)。超高通量，單次可處理上萬種樣品，可用于制備高密度的蛋白芯片、抗體芯片、多糖芯片、核酸芯片、基因芯片、小分子化合物芯片等，用于自身免疫抗體、生物標(biāo)記物、候選疫苗或藥物靶點(diǎn)的高通量篩選，以及疾病研究和新藥研發(fā)等諸多科研和臨床領(lǐng)域。