文獻(xiàn)分享：Nat. Mater. 新型LNP用于肝外器官的靶向遞送

脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）作為mRNA遞送的有效載體，在遺傳性疾病和傳染病的疫苗開發(fā)中展現(xiàn)了巨大潛力。然而，系統(tǒng)給藥后LNPs傾向于在肝臟中積累，限制了其在其他組織中的應(yīng)用。為解決這一問題，研究者們開發(fā)了多種策略，包括配體修飾、組分優(yōu)化和脂質(zhì)開發(fā)等，以實現(xiàn)mRNA的非肝組織靶向遞送。

近日，北京大學(xué)程強(qiáng)課題組在Nature Materials發(fā)表題為“Tissue-specific mRNA delivery and prime editing with peptide–ionizable lipid nanoparticles”的研究。本研究提出了一種基于肽-可離子化脂質(zhì)（Peptide Ionizable Lipids, PILs）的新型LNPs平臺，通過理性設(shè)計PILs的結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了對mRNA的組織特異性遞送和高效基因編輯。

示意圖
 

01實驗結(jié)果
PILs的合成與表征
研究成功設(shè)計并合成了超過120種結(jié)構(gòu)多樣的PILs，這些PILs由天然氨基酸（或其它功能性構(gòu)建模塊）和人工烷基化離子化Fmoc保護(hù)氨基酸（AIFAs）通過SPSS方法模塊化合成。具體地，通過Fmoc自脫保護(hù)反應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)Fmoc-based SPSS技術(shù)，研究合成了包含飽和烷基鏈（a-tails）、含羥基烷基鏈（e-tails）、酰胺鍵（aam-tails）和酯鍵（aat-tails）的AIFAs。最終，研究獲得了75種結(jié)構(gòu)明確的PILs，命名為AnBm，其中“A”代表烷基尾鏈類型，“n”代表烷基鏈長度，“B”代表賴氨酸或其類似物，“m”代表AIFAs的數(shù)量（圖1b）。

通過1H NMR和質(zhì)譜驗證了合成的PILs的結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步通過微流控混合技術(shù)將PILs與mRNA及輔助脂質(zhì)（膽固醇、DSPC和PEG-DMG）混合制備成PIL-LNPs。cryo-TEM觀察顯示，a12K4 LNPs主要呈現(xiàn)經(jīng)典的“實心核”結(jié)構(gòu)，少數(shù)LNPs顯示“囊泡”和“空雙層囊泡”結(jié)構(gòu)（圖1b）。此外，TNS測定顯示，隨著AIFAs數(shù)量的增加，PILs的pKa值逐漸降低，這可能是由于PILs單體間通過共價酰胺鍵更緊密地排列，增加了離子化氨基中心間的靜電排斥，從而需要更低的pH值來實現(xiàn)離子化（圖1b）。

Fig. 1 | Construction of PIL library and PIL-based mRNA-LNPs

SAR與SSR分析
結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系（SAR），研究首先探索了PILs結(jié)構(gòu)對mRNA-LNP體內(nèi)遞送效率的影響。通過靜脈注射LNPs至C57BL/6小鼠，研究發(fā)現(xiàn)12碳烷基鏈長度的PILs表現(xiàn)出最高的遞送效率（圖2c-e）。進(jìn)一步分析顯示，對于a-tails和e-tails，最優(yōu)的AIFA數(shù)量通常為4（圖2f）。值得注意的是，a12K4在所有評估的PILs中脫穎而出，成為領(lǐng)先的候選結(jié)構(gòu)。

為了進(jìn)一步優(yōu)化，研究合成了包含不同側(cè)鏈長度和類型的賴氨酸類似物（如Orn、Dab和Dap）的PILs。結(jié)果顯示，Dab-PILs表現(xiàn)出比其他類似物更優(yōu)的遞送效率，其中a12Dab4的Luc表達(dá)量比初始領(lǐng)先的a12K4高出1.36倍（圖2k）。相比之下，Dap-PILs完全喪失了mRNA遞送能力，突顯了側(cè)鏈結(jié)構(gòu)和堿度對PILs設(shè)計的重要性（圖2k）。

Fig. 2 | SAR of PILs.

結(jié)構(gòu)-選擇性關(guān)系（SSR）
接下來，研究分析了PILs結(jié)構(gòu)對組織選擇性的影響。通過計算肝臟與脾臟的相對Luc表達(dá)量，研究發(fā)現(xiàn)含有3-4個AIFAs且烷基鏈長度為10-14的PILs主要介導(dǎo)mRNA在肝臟中的遞送（>80%），這可能與其相對較低的pKa值（6.0-6.7）有關(guān)，該范圍被認(rèn)為對肝臟遞送最優(yōu)（圖3b）。進(jìn)一步探索不同尾鏈類型對組織選擇性的影響，研究發(fā)現(xiàn)與a-tails相比，e-tails并未提高mRNA在肝臟中的遞送效率，甚至在某些情況下降低了效率（圖2g）。通過合成三種a12K4的混合尾鏈變體，研究發(fā)現(xiàn)增加e-tails的比例顯著降低了肝臟中的mRNA表達(dá)（圖2i），推測PILs中已存在的酰胺鍵可能消除了對額外羥基的需求。
 

Fig. 3 | SSR of PILs

組織特異性mRNA遞送
研究展示了PILOT LNPs的構(gòu)建策略，即通過修飾PILs的特定氨基酸來實現(xiàn)對不同組織的特異性遞送。研究選擇了a12K2作為母體PIL，通過引入不同功能的氨基酸（如帶正電的H、K、R，帶負(fù)電的E、D，以及特殊氨基酸如C、P、F、Y、W等）來合成一系列PILOT LNPs（圖4b, c）。例如，圖4d顯示了帶正電氨基酸修飾的PILs（如Ha12K2, Ka12K2, Ra12K2）在肝臟和脾臟中的特異性遞送，其中Ha12K2在肝臟中的特異性最高（94.5%），而Ka12K2和Ra12K2則顯著提高了在脾臟中的遞送效率（>93.1%）。圖4e進(jìn)一步驗證了這些結(jié)果，通過流式細(xì)胞術(shù)分析了不同PILOT LNPs處理后小鼠肝臟、脾臟和肺中的熒光強(qiáng)度，證實了帶正電氨基酸修飾的PILs能夠顯著提高在這些組織中的mRNA表達(dá)。

研究展示了特殊氨基酸和芳香族氨基酸修飾的PILs在肝臟和脾臟中的特異性遞送效果。例如，Ca12K2（半胱氨酸修飾）顯著提高了在肝臟中的mRNA遞送效率和特異性（圖4f-g），而Fa12K2（苯丙氨酸修飾）和Ya12K2（酪氨酸修飾）則分別增強(qiáng)了在肝臟和脾臟中的表達(dá)（圖4h）。

研究還展示了多重氨基酸修飾和功能性分子引入對PILs組織選擇性的影響。例如，圖4m顯示了通過引入賴氨酸-酪氨酸二肽（Am-KYa12K4）顯著提高了在胸腺中的mRNA表達(dá)，同時減少了在其他組織中的表達(dá)。此外，圖4n展示了通過引入骨靶向分子Ale（阿侖膦酸鈉）顯著提高了在股骨和脛骨中的mRNA表達(dá)，表明PILOT平臺具有廣泛的組織靶向潛力。

Fig. 4 | Development of PILOT LNPs.

PILOT LNPs在體內(nèi)外遞送mRNA時的穩(wěn)定性和融合性對其遞送效率的影響
體外轉(zhuǎn)染效率，與基準(zhǔn)脂質(zhì)ALC-0315相比，含有1-3個AIFAs的PILs通常表現(xiàn)出更高的體外轉(zhuǎn)染效率（圖5a, b）。然而，體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，含有3-5個AIFAs的PILs表現(xiàn)出更高的遞送效率（圖2f），這表明體內(nèi)外性能存在顯著差異。

血清穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示，含有更多AIFAs和更長烷基鏈的PILs傾向于形成更穩(wěn)定的LNPs（圖5d-f），這有助于在體內(nèi)循環(huán)中保持mRNA的完整性。然而，過度穩(wěn)定的LNPs可能導(dǎo)致mRNA釋放不足，從而影響遞送效率（圖5d）。LNPs的融合性和膜裂解活性結(jié)果顯示，含有12個碳原子烷基鏈的PILs表現(xiàn)出最高的脂質(zhì)融合能力（圖5h, i），這有助于在體內(nèi)外實現(xiàn)高效的mRNA遞送。

融合性評估（圖5h、i）表明，含有12個碳原子烷基鏈的PILs表現(xiàn)出最高的脂質(zhì)融合能力。脂質(zhì)融合是LNPs與細(xì)胞膜相互作用的重要過程，高融合性有助于LNPs更有效地與細(xì)胞膜融合，從而促進(jìn)mRNA進(jìn)入細(xì)胞。膜裂解活性評估（圖5j）顯示，a12K4和a12Dab4在酸性條件下（如內(nèi)吞體pH 5.5）表現(xiàn)出最強(qiáng)的膜裂解活性。在細(xì)胞內(nèi)吞過程中，LNPs會被包裹在內(nèi)吞體中，而內(nèi)吞體的酸性環(huán)境可以激活LNPs的膜裂解活性，使其破壞內(nèi)吞體膜，將mRNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中（圖5k、l）。

綜合上述結(jié)果，研究揭示了mRNA轉(zhuǎn)染效率在體內(nèi)外存在的差異，具體如下：體外應(yīng)用的脂質(zhì)納米顆粒（LNPs）需要具備正表面電荷以實現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)化，具備高融合性以實現(xiàn)內(nèi)吞體逃逸，同時具備中低穩(wěn)定性以確保mRNA充分釋放。因此，滿足上述標(biāo)準(zhǔn)的含有1 - 2個人工合成的烷基化離子化Fmoc保護(hù)氨基酸（AIFAs）的聚離子液體（PILs），在體外表現(xiàn)出更優(yōu)的性能。相比之下，體內(nèi)給藥的LNPs則需要具備高穩(wěn)定性以維持血液循環(huán)，需要不同的電荷特性以形成不同的蛋白質(zhì)冠組成并實現(xiàn)器官靶向性，同時還需要具備高融合性以實現(xiàn)內(nèi)吞體逃逸。因此，像a12K4和a12Dab4這樣更穩(wěn)定且更具融合性的PILs，在體內(nèi)表現(xiàn)出更強(qiáng)的mRNA遞送能力�？傊�，這些重要的LNP特性對體內(nèi)外不同過程中的各個環(huán)節(jié)有著不同程度的影響，共同決定了mRNA - LNP轉(zhuǎn)染在體內(nèi)外的差異。

Fig. 5 | In vitro and in vivo discrepancies of mRNA delivery by PILOT LNPs.

組織特異性基因編輯
利用PILOT LNPs遞送Cre重組酶mRNA，研究在Ai9報告小鼠中實現(xiàn)了對肝臟、肺和脾臟等組織的特異性基因編輯。生物發(fā)光成像顯示，a12Dab4 Liver PILOT LNPs、Am-Ka12K4 Lung PILOT LNPs和a12K4E-Ca Spleen PILOT LNPs分別在其目標(biāo)組織中實現(xiàn)了顯著的tdTomato蛋白表達(dá)，而在其他組織中的表達(dá)可忽略不計（圖6b-c）。流式細(xì)胞術(shù)分析進(jìn)一步揭示了各組織中被成功編輯的細(xì)胞類型及其比例（圖6d）。

通過共遞送PEmax mRNA和epegRNA，研究首次實現(xiàn)了對肝臟和肺組織的特異性Prime編輯。利用HEK293T PE報告細(xì)胞系篩選出高效的epegRNA（圖6e），研究制備了包含PEmax mRNA和epegRNA的all-in-one LNPs，并在體外驗證了其編輯效率（圖6g-h）。進(jìn)一步，通過靜脈注射PILOT LNPs至EGFP報告小鼠，研究在肝臟和肺組織中觀察到了顯著的EGFP陽性細(xì)胞（圖6j和補(bǔ)充圖90）。NGS分析顯示，肝臟中的T-to-C點校正效率為13.3%，肺中為7.4%（圖6k）。

Fig. 6 | Organ-specific gene editing by PILOT LNPs.

02小結(jié)
本研究通過理性設(shè)計PILs的結(jié)構(gòu)，成功開發(fā)了一種普適且可預(yù)測的LNPs平臺，實現(xiàn)了對mRNA的組織特異性遞送和高效基因編輯。這一平臺不僅克服了傳統(tǒng)LNPs在非肝組織中遞送效率低的問題，還為基于mRNA的基因編輯治療提供了新的策略。未來，我們將進(jìn)一步優(yōu)化PILs的設(shè)計，探索更多功能性分子的引入，以及在更多組織類型中驗證PILOT平臺的普適性和有效性。

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參考文獻(xiàn)：Tissue-specific mRNA delivery and prime editing with peptide–ionizable lipid nanoparticles. https://doi.org/10.1038/s41563-025-02320-9