標(biāo)簽蛋白親和層析的分類、特性及選擇策略與實(shí)驗(yàn)步驟

標(biāo)簽蛋白親和層析是生物研究中核心的蛋白質(zhì)分離技術(shù)，其本質(zhì)是通過(guò)在目標(biāo)蛋白的 N 端或 C 端融合一段具有特定理化性質(zhì)的多肽（即 “標(biāo)簽”），利用標(biāo)簽與特定配體之間的特異性相互作用，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的高效分離與富集。

標(biāo)簽蛋白親和層析具有特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、純化效率高、回收率高且能保持蛋白活性等顯著優(yōu)勢(shì)，已成為重組蛋白表達(dá)后分離純化的首選技術(shù)，經(jīng)常用于標(biāo)簽蛋白純化的第一步。

標(biāo)簽蛋白親和層析基于生物分子間的特異性識(shí)別與結(jié)合的原理：融合標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白通過(guò)層析柱時(shí)，標(biāo)簽與層析柱上的配體發(fā)生特異性相互作用而被吸附，雜蛋白則因不具有標(biāo)簽直接流出；隨后通過(guò)改變洗脫條件（如調(diào)節(jié) pH 值、離子強(qiáng)度或加入競(jìng)爭(zhēng)性配體），使目標(biāo)蛋白與配體解離，從而獲得高純度的重組蛋白。

一、常用標(biāo)簽的分類及特性介紹
1、His 標(biāo)簽（組氨酸標(biāo)簽）
His 標(biāo)簽是最常用的親和標(biāo)簽之一，通常由 6-10 個(gè)連續(xù)的組氨酸殘基組成（以 6×His 標(biāo)簽最為常見(jiàn)）。其核心作用機(jī)制是組氨酸殘基中的咪唑環(huán)能與鎳離子（Ni²⁺）、鈷離子（Co²⁺）等過(guò)渡金屬離子發(fā)生特異性螯合作用，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的吸附與純化。

- 優(yōu)勢(shì)：
分子量�。�6×His 約 0.8 kDa），對(duì)目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及細(xì)胞定位影響極小，通常不需要切除；
可在天然或變性條件下進(jìn)行，可直接用于包涵體柱上復(fù)性和純化；
免疫原性較低；

- 缺點(diǎn)：特異性相對(duì)較弱，部分富含組氨酸的雜蛋白可能會(huì)發(fā)生非特異性結(jié)合，導(dǎo)致純化產(chǎn)物純度下降，可通過(guò)優(yōu)化洗脫條件（如梯度咪唑洗脫）改善。

2、GST 標(biāo)簽（谷胱甘肽 S - 轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽）
GST 標(biāo)簽是一種分子量較大的融合標(biāo)簽（約 26 kDa），來(lái)源于大腸桿菌的谷胱甘肽 S - 轉(zhuǎn)移酶。其純化原理是 GST 能與固定在層析介質(zhì)上的谷胱甘肽（GSH）發(fā)生特異性結(jié)合，通過(guò)谷胱甘肽洗脫可獲得目標(biāo)蛋白。

- 優(yōu)勢(shì)：
結(jié)合特異性高，純化產(chǎn)物純度通常較高；
具有促進(jìn)蛋白折疊的作用，可提高重組蛋白的可溶性，尤其適用于表達(dá)易形成包涵體的蛋白；
純化條件溫和，能最大程度保持蛋白活性；

- 缺點(diǎn)：
分子量較大，可能會(huì)影響目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，尤其對(duì)小分子蛋白的影響更為顯著；純化后可通過(guò)腸激酶（貨號(hào)：UA070095），凝血酶（貨號(hào)：27084601），rTEV酶（貨號(hào)：UA070003），HRV 3C酶（貨號(hào)：UA070044）等切除標(biāo)簽。

3、MBP 標(biāo)簽（麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽）
MBP 標(biāo)簽來(lái)源于大腸桿菌的麥芽糖結(jié)合蛋白，分子量約 42 kDa，其純化原理是 MBP 能與固定化的麥芽糖或直鏈淀粉發(fā)生特異性結(jié)合，通過(guò)麥芽糖洗脫實(shí)現(xiàn)純化。

- 優(yōu)勢(shì)：
具有極強(qiáng)的促可溶性作用，遠(yuǎn)優(yōu)于 GST 標(biāo)簽，是表達(dá)難溶性蛋白的首選標(biāo)簽之一；
結(jié)合特異性高，純化產(chǎn)物純度高；
純化條件溫和，能最大程度保持蛋白活性；

- 缺點(diǎn)：
分子量較大，可能會(huì)影響目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，尤其對(duì)小分子蛋白的影響更為顯著；純化后可通過(guò)腸激酶（貨號(hào)：UA070095），凝血酶（貨號(hào)：27084601），rTEV酶（貨號(hào)：UA070003），HRV 3C酶（貨號(hào)：UA070044）等切除標(biāo)簽。

4、Strep 標(biāo)簽（鏈霉親和素結(jié)合標(biāo)簽）
Strep 標(biāo)簽是一類短肽標(biāo)簽，常用的 Strep II 標(biāo)簽由 8 個(gè)氨基酸殘基組成（WSHPQFEK），分子量約 1 kDa。其純化原理是 Strep 標(biāo)簽?zāi)芘c鏈霉親和素的改造體（Strep-Tactin）發(fā)生特異性結(jié)合，通過(guò)生物素或脫硫生物素洗脫實(shí)現(xiàn)純化。

- 優(yōu)勢(shì)：
特異性極高，幾乎無(wú)非特異性結(jié)合，純化產(chǎn)物純度高；
分子量小，對(duì)目標(biāo)蛋白影響��；
可在天然或變性條件下進(jìn)行，可直接用于包涵體柱上復(fù)性和純化；

- 缺點(diǎn)：
價(jià)格較高，純化成本高于 His 標(biāo)簽與 GST 標(biāo)簽；
需使用高濃度生物素洗脫，可能影響部分蛋白的活性。

5、Protein Select 標(biāo)簽（Cytiva專利）
Cytiva Protein Select填料是一種親和層析填料，用于純化使用自我裂解且不留痕跡的Cytiva Protein Select標(biāo)簽的重組蛋白，獲得無(wú)標(biāo)簽的天然蛋白質(zhì)。

- 優(yōu)勢(shì)：
使用Protein Select填料純化時(shí)，蛋白發(fā)生自裂解去除標(biāo)簽，在洗脫時(shí)沒(méi)有殘留的標(biāo)簽氨基酸；

- 缺點(diǎn)：
無(wú)成品質(zhì)粒載體，需要自己構(gòu)建質(zhì)粒時(shí)添加Protein Select標(biāo)簽；

6.FLAG 標(biāo)簽
FLAG 標(biāo)簽是由 8 個(gè)氨基酸殘基組成的短肽標(biāo)簽（DYKDDDDK），分子量約 1 kDa。其純化原理是通過(guò)抗 FLAG 抗體與標(biāo)簽的特異性免疫結(jié)合實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的富集，可通過(guò) FLAG 肽段競(jìng)爭(zhēng)洗脫。

- 優(yōu)勢(shì)：
特異性高，抗 FLAG 抗體的識(shí)別具有高度專一性，純化產(chǎn)物純度高；
分子量小，對(duì)目標(biāo)蛋白影響�。�

- 缺點(diǎn)：
填料價(jià)格較高，純化成本高；
抗體與標(biāo)簽的結(jié)合可能受緩沖液成分影響；
難再生，不適合重復(fù)使用或者批量使用；

二、標(biāo)簽選擇策略與影響因素
選擇合適的標(biāo)簽是實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白高效純化的關(guān)鍵，需綜合考慮目標(biāo)蛋白的特性、表達(dá)系統(tǒng)、實(shí)驗(yàn)?zāi)康�、純化成本等因素�?/span>
（一）根據(jù)目標(biāo)蛋白的特性選擇
1、蛋白可溶性：若目標(biāo)蛋白為易溶性蛋白，優(yōu)先選擇分子量小、對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)影響小的標(biāo)簽（如 His 標(biāo)簽、Strep 標(biāo)簽）；若目標(biāo)蛋白為疏水性強(qiáng)、易形成包涵體的難溶性蛋白，應(yīng)選擇具有促可溶性作用的標(biāo)簽（如 MBP 標(biāo)簽、GST 標(biāo)簽），其中 MBP 標(biāo)簽的促溶效果最優(yōu)，是難溶性蛋白的首選。

2、蛋白分子量：對(duì)于小分子蛋白（分子量＜20 kDa），如果使用分子量較大的標(biāo)簽（如 GST、MBP）會(huì)占據(jù)目標(biāo)蛋白的大部分空間，影響其結(jié)構(gòu)與功能，需要切除標(biāo)簽；

3、樣品及緩沖液成分：如果緩沖液或者樣品中含有變性劑等成分，應(yīng)選擇變性環(huán)境可用的標(biāo)簽（如 His 標(biāo)簽、Strep 標(biāo)簽），GST，MBP，F(xiàn)lag標(biāo)簽在變性環(huán)境下不可用；如果樣品中含有高濃度咪唑或者DTT成分，不適合使用普通的His標(biāo)簽純化柱，可以使用耐受性高的Ni Excel預(yù)裝柱和填料（貨號(hào)：29048586, 17371201）;

（二）根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇
1、實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模制備（如蛋白結(jié)構(gòu)解析、功能驗(yàn)證）：如需快速獲得高純度蛋白，優(yōu)先選擇 His 標(biāo)簽（操作簡(jiǎn)便、成本低）；如果蛋白可溶性差，選擇 GST，MBP 標(biāo)簽；如果樣品量較少（膜蛋白等），優(yōu)先選擇高特異性標(biāo)簽（Strep標(biāo)簽）；

2、工業(yè)級(jí)大規(guī)模生產(chǎn)（如生物制藥）：需綜合考慮純化效率、成本、產(chǎn)物安全性等因素。His 標(biāo)簽因成本低、流程簡(jiǎn)便，是工業(yè)生產(chǎn)的常用選擇；Strep 標(biāo)簽因特異性高、產(chǎn)物純度高，適用于對(duì)純度要求極高的藥物生產(chǎn)，但需權(quán)衡成本；GST，MBP標(biāo)簽需要酶切，增加步驟和成本；

三、標(biāo)簽蛋白純化步驟
（1）使用蛋白純化儀器純化
以下以Cytiva的HisTrap HP 5ml（貨號(hào)：17524801）的預(yù)裝柱為例為大家介紹。根據(jù)使用的標(biāo)簽，選擇對(duì)應(yīng)的純化產(chǎn)品：使用純化填料選擇小助手：三步選出最合適產(chǎn)品https://mobile.univ-bio.com/pageA/proteinTool2/proteinTool2

前期質(zhì)粒構(gòu)建和蛋白表達(dá)的流程可以參考：原核標(biāo)簽蛋白純化解決方案https://www.univ-bio.com/study-center/solution/Technology/PPP.html

正文：
1、配制緩沖液
按照以下配方進(jìn)行緩沖液配制，
結(jié)合緩沖液： 20mM 磷酸鈉緩沖液， 0.5M 氯化鈉， 20-40mM 咪唑， PH7.4
洗脫緩沖液： 20mM 磷酸鈉緩沖液， 0.5M 氯化鈉， 500mM 咪唑， PH7.4
緩沖液配制完成后需要預(yù)先過(guò)濾和超聲去除氣泡。
其他層析柱所需緩沖液參考說(shuō)明書進(jìn)行配制。

2、樣品處理
大腸桿菌菌體通過(guò)離心收集（16,000g for 3 min），菌體沉淀用裂解液進(jìn)行懸�。�100 μl of 50 mM Tris–HCl buffer, pH 8.0, containing 200 mM NaCl, 2% Triton X-100 and 3 mM protease inhibitor PMSF），然后冰上超聲20次（sonicated 3 s with 7 s intervals between each pulse）。

離心取上清，用0.45um濾膜進(jìn)行過(guò)濾。

3、開機(jī)
先打開儀器主機(jī)電源，再打開電腦，儀器Power燈持續(xù)閃爍之后，打開Unicorn軟件并連接儀器；

4、泵洗
實(shí)驗(yàn)所需溶液入口浸入去離子水，進(jìn)行A，B泵泵洗；實(shí)驗(yàn)所需入口浸入所需緩沖液，進(jìn)行A，B泵泵洗；

5、樣品打入上樣環(huán)
連接上樣環(huán)至樣品進(jìn)口閥，先使用注射器用去離子水沖洗上樣環(huán)，然后用結(jié)合緩沖液潤(rùn)洗上樣環(huán)，然后打入樣品；

6、設(shè)置報(bào)警壓
設(shè)置Pre column pressure為0.5 MPa，Delta Column pressure為0.3 MPa。

7、連接層析柱
先系統(tǒng)給一個(gè)0.2ml/min的低流速，然后選擇柱位，然后使用液滴對(duì)液滴的方式連接層析柱；

8、平衡層析柱
先用3-5個(gè)柱體積的蒸餾水沖洗乙醇，然后用5個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液平衡柱子，建議流速為5ml/min。（1ml體積柱子流速為1ml/min）；

9、上樣
將Injection valve的狀態(tài)改為Inject；

10、洗雜
用結(jié)合緩沖液洗滌至少 10 到 15 個(gè)柱體積，直到吸收峰達(dá)到穩(wěn)定基線或在流出物中沒(méi)
有物質(zhì)流出。洗滌過(guò)程中建議保持流速為 5ml/min。（1ml體積柱子流速為1-2ml/min）；

11、洗脫
用洗脫緩沖液采用一步洗脫或者線性梯度洗脫（洗脫液濃度梯度0% to 100%）。一步洗脫通常 5 個(gè)柱體積，線性洗脫通常 10-20 個(gè)柱體積。在洗脫過(guò)程中保持流速為5ml/min。（1ml體積柱子流速為1-2ml/min）；

12、再生
洗脫后，用 3-5 個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌柱子，然后加入 20%乙醇。擰上柱子上下的堵頭，防止柱子變干。

13、跑膠檢測(cè)
重力純化
左上角：
以下以Cytiva的Ni Sepharose 6FF 5ml（貨號(hào)：17531806）的填料為例為大家介紹。根據(jù)使用的標(biāo)簽，選擇對(duì)應(yīng)的純化柱產(chǎn)品：使用純化填料選擇小助手：三步選出最合適產(chǎn)品https://mobile.univ-bio.com/pageA/proteinTool2/proteinTool2

前期質(zhì)粒構(gòu)建和蛋白表達(dá)的流程可以參考：原核標(biāo)簽蛋白純化解決方案https://www.univ-bio.com/study-center/solution/Technology/PPP.html

正文：
1、配制緩沖液
按照以下配方進(jìn)行緩沖液配制，
結(jié)合緩沖液： 20mM 磷酸鈉緩沖液， 0.5M 氯化鈉， 20-40mM 咪唑， PH7.4
洗脫緩沖液： 20mM 磷酸鈉緩沖液， 0.5M 氯化鈉， 500mM 咪唑， PH7.4
緩沖液配制完成后需要預(yù)先過(guò)濾和超聲去除氣泡。
其他層析柱所需緩沖液參考說(shuō)明書進(jìn)行配制。

2、樣品處理
大腸桿菌菌體通過(guò)離心收集（16,000g for 3 min），菌體沉淀用裂解液進(jìn)行懸�。�100 μl of 50 mM Tris–HCl buffer, pH 8.0, containing 200 mM NaCl, 2% Triton X-100 and 3 mM protease inhibitor PMSF），然后冰上超聲20次（sonicated 3 s with 7 s intervals between each pulse）。

離心取上清，用0.45um濾膜進(jìn)行過(guò)濾。

3、層析空柱準(zhǔn)備
將濾膜放入重力空柱中，用20%乙醇潤(rùn)洗濾膜，再用蒸餾水潤(rùn)洗濾膜；

4、填料準(zhǔn)備
輕柔震蕩直到填料懸濁液均一，將需要量的懸濁液從瓶中轉(zhuǎn)移至離心管中，Ni Sepharose 6FF填料的載量是40mg His標(biāo)簽重組蛋白/ml填料，例如需要純化100mg蛋白，則需要3ml填料。（每種填料的載量不同，需參考說(shuō)明書）。

5、平衡填料
將填料放入重力空柱中，先用5個(gè)柱體積去離子水平衡填料，再用5個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液平衡填料；

6、樣品結(jié)合
將填料轉(zhuǎn)移至離心管中，加入結(jié)合緩沖液和樣品，放在搖床上緩慢搖晃1h，讓樣品和填料充分混合；

7、洗雜
垂直放置重力空柱，將填料和樣品混合物加入到重力空柱中；用結(jié)合緩沖液沖洗5-10個(gè)柱體積，收集流出物；

8、洗脫
用洗脫緩沖液沖洗5-10個(gè)柱體積，收集流出物；

9、再生
洗脫后，用 3-5 個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌柱子，然后加入 20%乙醇。擰上柱子上下的堵頭，防止柱子變干。

10、跑膠檢測(cè)

部分熱賣現(xiàn)貨產(chǎn)品
1、標(biāo)簽親和層析

貨號(hào)	品名	規(guī)格	用途
17524701	HisTrap HP	5 × 1 ml	His標(biāo)簽蛋白純化（預(yù)裝柱）
17524802	HisTrap HP	5 × 5 ml	His標(biāo)簽蛋白純化（預(yù)裝柱）
17531901	HisTrap FF	5 × 1 ml	His標(biāo)簽蛋白純化（預(yù)裝柱）
17525501	HisTrap FF	5 × 5 ml	His標(biāo)簽蛋白純化（預(yù)裝柱）
29048586	HisTrap excel	1 x 1 ml	His標(biāo)簽蛋白純化（預(yù)裝柱）
29048565	HiTrap TALON crude	1 × 1 ml	His標(biāo)簽蛋白純化（預(yù)裝柱）
17526801	Ni Sepharose HP	25 ml	His標(biāo)簽蛋白純化（填料）
17526802	Ni Sepharose HP	100 ml	His標(biāo)簽蛋白純化（填料）
17531806	Ni Sepharose 6 FF	5 ml	His標(biāo)簽蛋白純化（填料）
17531801	Ni Sepharose 6 FF	25 ml	His標(biāo)簽蛋白純化（填料）
17371201	Ni Sepharose excel	25ml	His標(biāo)簽蛋白純化（填料）
17528101	GSTrap HP	5 × 1 ml	GST標(biāo)簽蛋白純化（預(yù)裝柱）
17513001	GSTrap FF	5 × 1 ml	GST標(biāo)簽蛋白純化（預(yù)裝柱）
17527901	Glutathione Sepharose HP	25 ml	GST標(biāo)簽蛋白純化（填料）
17513201	Glutathione Sepharose 4 FF	25 ml	GST標(biāo)簽蛋白純化（填料）
17075601	Glutathione Sepharose 4B	10 ml	GST標(biāo)簽蛋白純化（填料）
29401317	StrepTrap XT	1 × 1 ml	Strep標(biāo)簽蛋白純化（預(yù)裝柱）
29401324	StrepTactin Sepharose XT	10ml	Strep標(biāo)簽蛋白純化（預(yù)裝柱）
28918779	MBPTrap HP	1 × 5 ml	MBP標(biāo)簽蛋白純化(預(yù)裝柱)
28935597	Dextrin Sepharose HP	25ml	MBP標(biāo)簽蛋白純化(填料)
17542151	HiTrap Protein Select	1 x 1 mL	Protein Select標(biāo)簽蛋白純化(預(yù)裝柱)
17542101	Protein Select resin 25 mL	25ml	Protein Select標(biāo)簽蛋白純化(填料)
S0B1559	Anti-FLAG (DYKDDDDK) Tag agarose Beads	1ml/5ml/10ml	Flag標(biāo)簽蛋白純化（填料）

2、細(xì)胞培養(yǎng)，標(biāo)簽剪切酶產(chǎn)品

貨號(hào)	名稱	規(guī)格
SH30406.05	New Zealand FBS	500mL
SV30208.02	Australia FBS	500mL
abs974	胎牛血清（標(biāo)準(zhǔn)級(jí)）	500mL
abs972	胎牛血清（優(yōu)級(jí)）	500mL
abs9825-1L	HEK293細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基	1L
UA070095	Recombinant Enterokinase, His tag (High specific activity)	500U
UA070003	Recombinant Tobacco Etch Virus Protease (rTEV)	1KU
UA070004	Recombinant SUMO Protease, Yeast	1KU
UA070044	HRV 3C Protease	500U