流式實驗避坑指南：非特異性結(jié)合的成因與預(yù)防
眾所周知，抗原抗體反應(yīng)是特異性結(jié)合的，諸多利用抗原抗體反應(yīng)原理的實驗例如ELISA、WB、IF、IHC、IP等均是建立在抗原抗體反應(yīng)特異性的基礎(chǔ)上的，為了達(dá)到最佳實驗效果，降低非特異性吸附以提升檢測效果和可信度成為實驗的重點之一。流式實驗作為抗體應(yīng)用范圍之一，非特異性吸附的降低也十分重要，下面我們一起了解下流式實驗中常見的非特異性結(jié)合原因和解決辦法。
一、流式抗體使用過量
流式抗體使用濃度過高時，由于過高的使用濃度會大大提高非特異性結(jié)合的概率，這個在其他抗體應(yīng)用實驗中也是很常見的非特異性結(jié)合原因。在使用抗體時，建議按照廠家的推薦使用濃度使用，也可以根據(jù)自身樣本和實驗需求，摸索最合適的抗體使用濃度以達(dá)到最佳使用效果。同時注意，孵育時間過長也可能增加非特異性結(jié)合的概率哦，最好參考廠家指導(dǎo)的孵育時間。
二、非特異性黏附
抗體或染料分子可能通過疏水作用或靜電吸附與細(xì)胞膜、細(xì)胞骨架成分或其他蛋白非特異結(jié)合，這種黏附基本不分樣本不分蛋白。因此，在樣本洗滌液、封閉液或者抗體孵育液中通常含有胎牛血清或者BSA，以封閉這些位點盡量降低流式抗體非特異性黏附的可能。
三、Fc受體結(jié)合
許多免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、B細(xì)胞）表面表達(dá)Fcγ受體，能與抗體的Fc段結(jié)合，導(dǎo)致抗體“粘”在非目標(biāo)細(xì)胞上，這是檢測免疫細(xì)胞時產(chǎn)生大量假陽性的重要原因。因此需要在加入熒光抗體前，使用過量非特異性同源免疫球蛋白（如人用小鼠血清、人Fc阻斷劑、商品化Fc阻斷劑）或抗CD16/32抗體（針對小鼠樣本）封閉樣本的FC結(jié)合位點，降低因此產(chǎn)生的大量非特異性結(jié)合導(dǎo)致的假陽性。
四、抗體特異性不足
若流式抗體本身未經(jīng)嚴(yán)格驗證，特異性不足，可能會識別非目標(biāo)抗原，那也會因此導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性。因此，選擇經(jīng)過嚴(yán)格驗證的特異性抗體對于實驗尤為重要，尚恩生物采用國內(nèi)外高分文獻(xiàn)的克隆號抗體，抗體特異性、靈敏度、穩(wěn)定性有據(jù)可查，從根源上保障實驗的順利進(jìn)行，結(jié)果更可信。
五、熒光標(biāo)記物結(jié)合
某些熒光染料（尤其是串聯(lián)染料，如PE-Cy7、APC-Cy7）在光照或固定后易分解，產(chǎn)生游離的Cy染料，這些染料會非特異結(jié)合到任何蛋白上。因此在使用此類染料時應(yīng)注意保存時間和溫度，如果可能的話盡量避免使用這種染料。尚恩生物提供流式抗體配色服務(wù)，由深耕流式領(lǐng)域十余年的資深技術(shù)為您提供最佳流式抗體配色服務(wù)和實驗指導(dǎo)，為您的實驗保駕護(hù)航。
六、洗滌不充分
洗滌液配方、洗滌次數(shù)、時間等也會一定程度影響非特異性吸附的產(chǎn)生，通過增加洗滌次數(shù)、時間并使用合適的洗滌緩沖液，可以有效去除未結(jié)合的抗體，從而減少非特異性結(jié)合的影響。
七、死細(xì)胞影響
細(xì)胞死亡后會產(chǎn)生粘性物質(zhì)，主要是泄露的DNA等物質(zhì)可能吸附流式抗體導(dǎo)致假陽性。因此，在流式實驗時盡量使用活性高的新鮮組織或樣本，可以結(jié)合流式抗體熒光類型，選擇合適的細(xì)胞死活染料（Live/Dead dye） 在表面染色前進(jìn)行標(biāo)記，并在分析時將其排除。
▲SNK-028 SUNNCELL ® Violet 510(死活染料)
八、固定破膜過程
部分細(xì)胞檢測時，由于抗原存在于細(xì)胞內(nèi)部，因此需要進(jìn)行細(xì)胞固定和破膜以實現(xiàn)流式抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部檢測，但固定破膜過程會暴露細(xì)胞內(nèi)部大量非靶標(biāo)抗原，因此直接檢測會經(jīng)常出現(xiàn)背景升高的問題，因此大多會在破膜后使用含 permeabilization buffer（如含saponin）的洗滌/孵育緩沖液，并在需要的情況下在破膜后增加一步封閉。
▲SNAR-004 胞內(nèi)因子固定破膜劑 (即用型)
尚恩生物流式抗體產(chǎn)品采用國內(nèi)外高分文獻(xiàn)同樣克隆號的抗體為原料，進(jìn)口熒光染料通過優(yōu)化工藝高效標(biāo)記，有效保障了流式抗體特異性、靈敏度、穩(wěn)定性、熒光強(qiáng)度等基礎(chǔ)參數(shù)，實驗結(jié)果可重復(fù)性、認(rèn)可度都同時得到保障，實際使用效果不差于進(jìn)口品牌的同類產(chǎn)品。同時，尚恩生物提供的不僅僅是流式抗體產(chǎn)品，相應(yīng)的專業(yè)配色、實驗操作、數(shù)據(jù)分析等全流程指導(dǎo)服務(wù)同步在線，有效保證實驗的順利進(jìn)行。從產(chǎn)品到服務(wù)，尚恩生物均為您提供最佳選擇，歡迎選購。
