新一代抗體偶聯(lián)藥物（ADC）技術(shù)簡(jiǎn)介

本文來(lái)源于微信公眾： 研學(xué)Biotech 作者： GENTOP

傳統(tǒng)ADC已證明其價(jià)值，但也暴露了局限性：治療窗口窄、靶向毒性、耐藥性、異質(zhì)性高等。新一代技術(shù)旨在通過(guò)以下核心特征解決這些問(wèn)題：
1.高度均一性：從DAR隨機(jī)分布的“混合物”變?yōu)镈AR精確、位點(diǎn)特異的“單一產(chǎn)品”。
2.精準(zhǔn)遞送：利用更穩(wěn)定的連接子和新型載荷，確保藥物在正確時(shí)間、正確地點(diǎn)釋放。
3.更強(qiáng)效力與新型作用機(jī)制：使用更強(qiáng)效的載荷或非細(xì)胞毒性藥物，以克服耐藥并擴(kuò)大治療領(lǐng)域。
4.增強(qiáng)腫瘤穿透與選擇性：通過(guò)新型抗體格式或前藥策略，提高對(duì)實(shí)體瘤的療效并減少對(duì)正常組織的毒性。

新一代ADC技術(shù)正在從一門(mén)“藝術(shù)”轉(zhuǎn)變?yōu)橐婚T(mén)高度可控的“科學(xué)”。其發(fā)展趨勢(shì)是：

• 設(shè)計(jì)理性化：基于對(duì)靶點(diǎn)生物學(xué)、載荷藥理和連接子化學(xué)的深刻理解進(jìn)行理性設(shè)計(jì)。
• 技術(shù)平臺(tái)化：形成模塊化的抗體、連接子、載荷平臺(tái)，可快速組合成候選藥物。
• 應(yīng)用多元化：從晚期腫瘤治療向更前線治療、輔助治療乃至非腫瘤領(lǐng)域拓展。
• 聯(lián)合治療常規(guī)化：與免疫檢查點(diǎn)抑制劑、靶向藥等聯(lián)合使用，成為腫瘤綜合治療的基石方案。

最終目標(biāo)是通過(guò)持續(xù)的技術(shù)迭代，開(kāi)發(fā)出療效更高、毒性更低、應(yīng)用更廣的“智能”靶向藥物，為更多患者帶來(lái)希望。

今天為大家解讀一篇關(guān)于新一代ADC藥物技術(shù)的文章。以期為大家在ADC藥物研發(fā)設(shè)計(jì)方面提供參考。

1、 引言
抗體偶聯(lián)藥物通過(guò)抗體的靶向特異性，選擇性地將具有藥理活性的小分子遞送至病變細(xì)胞或組織，從而最大限度地減少對(duì)健康組織的不良影響。這種生物制品與小分子化合物的結(jié)合為疾病治療提供了新的機(jī)遇，同時(shí)也給藥物研發(fā)帶來(lái)了獨(dú)特的挑戰(zhàn)。第一代ADC在臨床上驗(yàn)證了有效性，同時(shí)也揭示了一些局限性，并推動(dòng)了該技術(shù)的進(jìn)一步改進(jìn)。傳統(tǒng)ADC主要使用auristatin或maytansinoid類(lèi)微管蛋白抑制劑，通過(guò)表面賴(lài)氨酸或鏈間半胱氨酸隨機(jī)連接至抗體。較新進(jìn)入臨床的ADC則包含了用于定點(diǎn)偶聯(lián)的工程化半胱氨酸和新型DNA損傷劑。本文概述了已在臨床前研究中展現(xiàn)出前景并有望轉(zhuǎn)化進(jìn)入臨床的關(guān)鍵技術(shù)創(chuàng)新。這些創(chuàng)新包括更多的細(xì)胞毒性藥物種類(lèi)，如Tubulysins、對(duì)稱(chēng)和不對(duì)稱(chēng)苯并二氮雜䓬二聚體、蒽環(huán)類(lèi)藥物以及鵝膏毒肽。日益豐富的連接子可實(shí)現(xiàn)二硫鍵重橋連，以及高疏水性藥物或高DAR值下的藥物偶聯(lián)。通過(guò)引入半胱氨酸、擴(kuò)展遺傳密碼、聚糖工程和化學(xué)酶法，已開(kāi)發(fā)出多種穩(wěn)健的定點(diǎn)偶聯(lián)方案。最后，探索遞送調(diào)節(jié)免疫激活和脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的藥物，用于癌癥以外的適應(yīng)癥�？傊�，這些進(jìn)展為增強(qiáng)和擴(kuò)大ADC作為新型靶向療法，治療癌癥及其他未滿(mǎn)足醫(yī)療需求高的疾病的治療帶來(lái)了巨大希望。
下文將總結(jié)藥物-連接子設(shè)計(jì)、抗體工程以及ADC在癌癥領(lǐng)域外的潛在應(yīng)用方面的最新進(jìn)展。表1提供了ADC代表性技術(shù)和構(gòu)建的概要。

表1 ADC技術(shù)與示例

2、 新型細(xì)胞毒素有效載荷和連接子
2.1 微管蛋白抑制劑
基于auristatin和maytansinoid的ADC藥物的臨床成功，促進(jìn)了對(duì)其他靶向微管蛋白有效載荷的評(píng)估。每種新有效載荷都有望在效力、旁觀者效應(yīng)、耐藥譜、副作用譜、偶聯(lián)難易度等方面提供一套互補(bǔ)的特性。其他有效載荷包括新型auristatins、dolastatins和maytansines，以及新型化學(xué)結(jié)構(gòu)類(lèi)型，如隱藻素和Tubulysins。下文將以Tubulysins為例進(jìn)行說(shuō)明。

Tubulysins最初從粘細(xì)菌中分離，是一類(lèi)獨(dú)特的肽類(lèi)化合物，能強(qiáng)效抑制微管蛋白聚合。許多不同的Tubulysins已從天然來(lái)源分離或通過(guò)合成獲得。Tubulysin D（圖1）是該類(lèi)化合物中已知效力最強(qiáng)的成員之一，在多種癌細(xì)胞系中表現(xiàn)出皮摩爾級(jí)的細(xì)胞毒性活性。作為ADC有效載荷，一些Tubulysins既能對(duì)多藥耐藥腫瘤發(fā)揮強(qiáng)效活性，又能殺死旁觀者細(xì)胞。天然Tubulysins的N,O-縮醛部分化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，促使人們尋找能保留高細(xì)胞毒性活性的更穩(wěn)定的衍生物。Cohen等人成功制備了曲妥珠單抗與穩(wěn)定的Tubulysin類(lèi)似物Tub-OH和Tub-OMOM的偶聯(lián)物。通過(guò)不可裂解的N-羥基琥珀酰亞胺連接子，將¹³¹I標(biāo)記和未標(biāo)記的Tubulysins與表面賴(lài)氨酸偶聯(lián)。

圖1 tubulysin D的結(jié)構(gòu)

2.2 苯并二氮雜䓬二聚體
吡咯并苯并二氮雜䓬二聚體是一類(lèi)強(qiáng)效、序列選擇性的DNA小溝結(jié)合劑，以SJG-136為例，圖2所示。SJG-136也稱(chēng)為SG2000，在支持性護(hù)理下，以最大耐受劑量30µg/m²/天，連續(xù)給藥3天（21天為一個(gè)周期），在晚期惡性腫瘤中顯示出初步的抗腫瘤活性跡象。通常，每個(gè)PBD單體在N10-C11位置含有一個(gè)親電亞胺基團(tuán)，可與鳥(niǎo)嘌呤堿基的C2-NH₂基團(tuán)共價(jià)連接。PBD能在低皮摩爾濃度下誘導(dǎo)DNA鏈間交聯(lián)和細(xì)胞毒性。

圖2 SJG-136/SG2000結(jié)構(gòu)示意圖（一種吡咯并苯二氮䓬二聚體）

吲哚啉并苯并二氮雜䓬二聚體是一個(gè)小溝結(jié)合劑家族，具有親電亞胺基團(tuán)。與PBD類(lèi)似，游離的IGN在體外和體內(nèi)均具有強(qiáng)效細(xì)胞毒性。含有對(duì)稱(chēng)雙亞胺IGN的ADC如預(yù)期般誘導(dǎo)了共價(jià)DNA加合物和交聯(lián)；然而，小鼠治療導(dǎo)致了延遲的毒性和死亡。相比之下，含有單亞胺的IGN僅誘導(dǎo)DNA烷基化。與基于IGN二聚體的ADC相比，含有可裂解二硫鍵連接子的單亞胺IGN抗CD33 ADC在體內(nèi)表現(xiàn)出高效力，且早期和晚期毒性降低，圖3所示。在DAR約為3時(shí)，該ADC顯示出對(duì)急性髓系白血病異種移植瘤的最小有效劑量為0.6 mg/kg，在小鼠中的最大耐受劑量為40 mg/kg。

圖3 IMGN-779結(jié)構(gòu)示意圖，一種含有吲哚并苯二氮䓬二聚體DGN462的抗CD33 ADC

2.3 蒽環(huán)類(lèi)藥物
這些DNA嵌入劑是應(yīng)用最廣泛的抗癌藥物類(lèi)別之一。蒽環(huán)類(lèi)藥物被認(rèn)為通過(guò)阻斷拓?fù)洚悩?gòu)酶II的活性并誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的形成來(lái)阻止DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄�；�于阿霉素的ADC是最早進(jìn)行臨床評(píng)估的ADC之一。然而，該化合物中等程度的效力、潛在的不可逆心臟毒性以及相關(guān)的耐藥機(jī)制阻礙了其更廣泛的開(kāi)發(fā)。新型蒽環(huán)類(lèi)藥物如奈莫柔比星及其主要代謝物PNU-159682（圖4）有潛力克服這些限制。與阿霉素相比，PNU-159682對(duì)一組癌細(xì)胞系的效力提高了1000倍，并且對(duì)具有多藥耐藥表型的細(xì)胞保留了活性。這些特性與PNU-159682對(duì)DNA異常緊密和穩(wěn)定的結(jié)合有關(guān)。

圖4 強(qiáng)效蒽環(huán)類(lèi)化合物與抗CD22-NMS249的結(jié)構(gòu)

Genentech團(tuán)隊(duì)通過(guò)mc-vc-PAB和二乙胺連接子將PNU-159682與抗CD22單抗偶聯(lián)得到CD22-NMS249（圖4）�？笴D22抗體是pinatuzumab的THIOMAB版本�？笴D22-NMS249在體外對(duì)親本非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系的效力比pinatuzumab vedotin強(qiáng)2至20倍。此外，單次1或2 mg/kg劑量的抗CD22-NMS249對(duì)四種NHL異種移植瘤均顯示出體內(nèi)療效。與pinatuzumab vedotin不同，抗CD22-NMS249克服了由p-糖蛋白過(guò)表達(dá)或在pinatuzumab vedotin存在下連續(xù)傳代誘導(dǎo)的耐藥性，這與游離奈莫柔比星及其主要代謝物不是p-糖蛋白底物的發(fā)現(xiàn)一致。

2.4 鵝膏毒肽
這些化合物構(gòu)成了一個(gè)雙環(huán)八肽毒素家族。研究最深入的成員是α-鵝膏蕈堿（圖5），由毒鵝膏菌產(chǎn)生。α-鵝膏蕈堿是真核生物RNA聚合酶II的強(qiáng)效特異性抑制劑。轉(zhuǎn)錄停滯會(huì)關(guān)閉翻譯和正常代謝過(guò)程，引發(fā)增殖和靜止腫瘤細(xì)胞的死亡。這種細(xì)胞毒性機(jī)制與當(dāng)前臨床階段ADC的機(jī)制互補(bǔ)。

圖5 α -鵝膏蕈肽與chiHEA125-ama ADC的結(jié)構(gòu)

在一項(xiàng)研究中，α-鵝膏蕈堿通過(guò)戊二酸連接子與抗EpCAM單抗chiHEA125的表面賴(lài)氨酸偶聯(lián)。在DAR為4-8時(shí)，該ADC對(duì)Colo205和MCF-7腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出個(gè)位數(shù)皮摩爾的效力，相對(duì)于非結(jié)合ADC具有驚人的100,000倍選擇性。在BxPc-3胰腺癌異種移植模型中測(cè)試時(shí)，單次2 mg/kg劑量后觀察到部分腫瘤消退，間隔一周給予兩次4 mg/kg劑量后觀察到完全消退。治療通常耐受性良好，然而，單次6和12 mg/kg劑量與明顯的肝毒性相關(guān)。這種副作用與意外鵝膏毒肽中毒后觀察到的肝毒性一致。盡管α-鵝膏蕈堿的膜滲透性差，但它可通過(guò)肝臟特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主動(dòng)攝取。這個(gè)問(wèn)題是鵝膏毒肽ADC項(xiàng)目的重要考量。

2.5 二硫鍵重橋連
目前處于臨床測(cè)試的ADC中，大多數(shù)涉及通過(guò)抗體的鏈間半胱氨酸殘基進(jìn)行偶聯(lián)。這種方法的局限性包括：對(duì)于DAR約4時(shí)形成異質(zhì)混合物，對(duì)于DAR約2時(shí)存在大量未偶聯(lián)的單抗，對(duì)于DAR約8時(shí)（使用傳統(tǒng)藥物-連接子）藥代動(dòng)力學(xué)和療效欠佳，丟失了通常穩(wěn)定重-輕和重-重鏈相互作用的共價(jià)鍵，以及傳統(tǒng)馬來(lái)酰亞胺連接子的血漿不穩(wěn)定性。原則上，這些限制可以通過(guò)"重橋連"連接子克服，該連接子與原始二硫鍵的配對(duì)半胱氨酸形成共價(jià)鍵，這一策略最初是為蛋白質(zhì)定點(diǎn)聚乙二醇化開(kāi)發(fā)的。該方法涉及部分或完全還原鏈間二硫鍵，然后與藥物-連接子反應(yīng)，后者共價(jià)"橋接"來(lái)自原始二硫鍵的半胱氨酸硫原子（圖6）。在大多數(shù)情況下，一個(gè)2或3碳的間隔基連接硫原子。這種方法的特點(diǎn)是，提供了定點(diǎn)特異性，而無(wú)需對(duì)抗體進(jìn)行任何工程改造。

圖6 二硫鍵重橋接策略示意圖。星號(hào)表示通過(guò)連接子偶聯(lián)的化學(xué)載荷，該連接子通過(guò)短（2或3碳）化學(xué)間隔基重新連接先前配對(duì)的半胱氨酸

關(guān)于這種策略的例子還有很多，例如圖7所示。據(jù)報(bào)道，所得硫醚鍵在血漿中比使用馬來(lái)酰亞胺化學(xué)形成的鍵更穩(wěn)定，后者容易發(fā)生逆邁克爾反應(yīng)。原則上，通過(guò)對(duì)完全還原的抗體進(jìn)行重橋連，可以獲得均質(zhì)DAR=4的ADC，或使用Fabs或其他抗體支架獲得均質(zhì)DAR=1的偶聯(lián)物。實(shí)際上，在某些情況下，鏈的完全重橋連仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，部分原因是鉸鏈區(qū)半胱氨酸之間形成鏈內(nèi)橋，這些半胱氨酸僅由兩個(gè)氨基酸隔開(kāi)。使用更長(zhǎng)的碳間隔基可能會(huì)加劇這個(gè)問(wèn)題。

圖7 基于單砜(a)或3,4-二溴馬來(lái)酰亞胺(b)雙烷基化反應(yīng)的二硫鍵重橋接方法

2.6 Fleximer™聚合物連接子
多項(xiàng)研究已證明在使用傳統(tǒng)藥物-連接子時(shí)，具有確定且低DAR值（通常為2）的均質(zhì)ADC的優(yōu)勢(shì)。然而，Mersana采取了不同的策略，使用親水性聚合物連接子生成具有高且異質(zhì)DAR值的ADC。這種可生物降解的聚合物連接子最初是為了提供一種喜樹(shù)堿前藥衍生物，以克服該分子的藥代動(dòng)力學(xué)限制。Mersana后來(lái)將這項(xiàng)技術(shù)用作克服某些ADC有效載荷疏水性限制的手段，并生成了DAR值在15至20范圍內(nèi)的ADC（圖8）。這些ADC在生理pH下相對(duì)穩(wěn)定，并在內(nèi)化進(jìn)入酸性?xún)?nèi)體后釋放有效載荷。使用Fleximer™在DAR約20時(shí)將長(zhǎng)春花堿類(lèi)似物連接到曲妥珠單抗，未觀察到Her2結(jié)合親和力有明顯損失�；�于曲妥珠單抗的ADC單次20 mg/kg劑量導(dǎo)致BT-474人乳腺癌異種移植瘤完全消退，治療后60天，100%的動(dòng)物檢測(cè)不到腫瘤。相比之下，使用非結(jié)合ADC或未偶聯(lián)曲妥珠單抗與藥物-連接子的混合物治療后，僅觀察到輕微的腫瘤生長(zhǎng)延遲，沒(méi)有腫瘤消退。

圖8 基于Fleximer聚合物技術(shù)的ADC基本結(jié)構(gòu)

3、 抗體改造
藥物-連接子化學(xué)的創(chuàng)新與改造抗體的新方法相輔相成，以促進(jìn)藥物偶聯(lián)。其中一個(gè)主要目的是生成具有確定DAR值的均質(zhì)ADC。如圖9所示，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種策略來(lái)使用工程化抗體或酶介導(dǎo)的偶聯(lián)制備定點(diǎn)特異性ADC。定點(diǎn)特異性ADC表現(xiàn)出改善的性能，主要是因?yàn)闆](méi)有快速清除的高DAR物種，并且與通過(guò)半胱氨酸硫醇進(jìn)行馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)相比，消除了逆邁克爾反應(yīng)。

圖9 位點(diǎn)特異性ADC的制備方法示意圖（ SECIS =硒代半胱氨酸插入序列）

3.1 工程化半胱氨酸
人IgG的恒定區(qū)不存在不成對(duì)半胱氨酸，可變區(qū)也很少出現(xiàn)。因此，引入的半胱氨酸可以提供可利用的化學(xué)手柄。然而，不成對(duì)半胱氨酸可能導(dǎo)致表達(dá)/分泌減少、蛋白質(zhì)聚集、二硫鍵混亂以及其他生產(chǎn)挑戰(zhàn)。這些因素限制了引入半胱氨酸的優(yōu)選位點(diǎn)數(shù)量，并促使人們經(jīng)驗(yàn)性地尋找對(duì)特定應(yīng)用最優(yōu)的位點(diǎn)。
Junutula等人率先利用工程化半胱氨酸制備定點(diǎn)特異性ADC，即THIOMABs。這項(xiàng)工作利用了之前開(kāi)發(fā)的噬菌體展示方法，來(lái)識(shí)別將活性半胱氨酸插入抗體Fab片段的位點(diǎn)。在全長(zhǎng)人IgG1背景下評(píng)估了輕鏈上的8個(gè)位點(diǎn)和重鏈上的4個(gè)位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)重鏈CH1結(jié)構(gòu)域中的A114C位點(diǎn)表現(xiàn)出良好的表達(dá)和偶聯(lián)效率。即使在這個(gè)優(yōu)選位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)引入的半胱氨酸在表達(dá)和純化后與谷胱甘肽、游離半胱氨酸等其他含硫醇化合物甚至抗體輕鏈形成二硫鍵連接。對(duì)于偶聯(lián)，將所有溶劑可及的（即引入的和鏈間的）二硫鍵還原，然后使用硫酸銅或脫氫抗壞血酸重新氧化鏈間二硫鍵。

與傳統(tǒng)ADC相比，TDC在體外表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合親和力，并且在OVCAR-3等卵巢癌模型中表現(xiàn)出相似或更好的臨床前療效。單次6 mg/kg劑量的TDC在每個(gè)模型中都能導(dǎo)致已建立腫瘤的消退或長(zhǎng)期控制。重要的是，TDC在大鼠中表現(xiàn)出更優(yōu)的藥代動(dòng)力學(xué)，在大鼠和食蟹猴中的耐受性提高了三到四倍。
工程化半胱氨酸顯著提高了與馬來(lái)酰亞胺形成的硫醚鍵的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，帶正電荷的環(huán)境促進(jìn)了琥珀酰亞胺環(huán)的水解，開(kāi)環(huán)最大限度地減少了因逆邁克爾反應(yīng)導(dǎo)致的藥物損失可能性。這項(xiàng)研究還檢驗(yàn)了將半胱氨酸引入抗體Fc區(qū)的影響。除了MUC16，針對(duì)Her2、STEAP1和CD22的抗體，在使用MMAE、DM1和蒽環(huán)類(lèi)有效載荷時(shí)，TDC也顯示出優(yōu)于傳統(tǒng)ADC的優(yōu)勢(shì)。

3.2 酶輔助偶聯(lián)
定點(diǎn)偶聯(lián)的另一種策略是利用酶對(duì)其底物的特異性。該方法利用了甲酰甘氨酸生成酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶、分選酶和葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶來(lái)修飾抗體的多肽或聚糖結(jié)構(gòu)。在某些情況下，首先通過(guò)引入內(nèi)部或末端寡肽標(biāo)簽來(lái)修飾抗體序列以促進(jìn)催化。引入標(biāo)簽的潛在免疫原性是一個(gè)理論上的關(guān)注點(diǎn)。

3.2.1 微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶
轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶（TG）催化伯胺與谷氨酰胺的γ-羧酰胺之間形成異肽鍵。TG幾乎存在于所有生物體中。來(lái)自放線菌的微生物TG廣泛用于食品工業(yè)，并曾用于生物素、聚乙二醇和放射性金屬螯合劑修飾蛋白質(zhì)。在這些早期研究中，對(duì)全長(zhǎng)鼠源單抗和肽標(biāo)簽化的單鏈Fv抗體進(jìn)行了TG標(biāo)記。研究證實(shí)，這種微生物TG對(duì)基于胺的底物具有混雜性，但對(duì)蛋白質(zhì)谷氨酰胺的識(shí)別更具限制性。

Schibli及其同事研究了將熒光團(tuán)與天然和去糖基化形式的嵌合IgG1抗L1-CAM抗體chCE7的偶聯(lián)。盡管最大取代率為每個(gè)mAb一個(gè)熒光團(tuán)，但與去糖基化mAb的偶聯(lián)效率明顯更高。該小組的后續(xù)研究表明，酶法去糖基化的chCE7優(yōu)先在Q295位點(diǎn)被修飾，而N297Q去糖基化突變體優(yōu)先在Q295和Q297位點(diǎn)被修飾。推測(cè)對(duì)這些谷氨酰胺的特異性源于它們位于人IgG1的柔性區(qū)域。

Rinat在人IgG1的90個(gè)表面可及位點(diǎn)插入了谷氨酰胺標(biāo)簽。12個(gè)位點(diǎn)適合偶聯(lián)，研究重點(diǎn)分別是在重鏈或輕鏈C末端添加LLQGA或GGLLQGA。使用抗M1S1抗體和通過(guò)可裂解AcLys-vc-PAB連接子連接的MMAD，制備了定點(diǎn)特異性和傳統(tǒng)ADC。通過(guò)TG介導(dǎo)的重鏈或輕鏈標(biāo)簽偶聯(lián)，在體外觀察到等效的效力，以及對(duì)小鼠BxPC3胰腺癌異種移植瘤的等效療效；然而，輕鏈偶聯(lián)在大鼠血漿中表現(xiàn)出更優(yōu)的藥代動(dòng)力學(xué)和穩(wěn)定性。大鼠血漿中的不穩(wěn)定性歸因于纈氨酸-瓜氨酸二肽的裂解，而不是TG異肽鍵的降解。相反，對(duì)于使用C6-vc-PAB連接子和新型auristatin抑制劑Aur-0101制備的ADC，在小鼠血漿中觀察到比大鼠血漿中更大的不穩(wěn)定性；然而，在猴和人血漿中觀察到了良好的穩(wěn)定性。使用TG制備了高度均質(zhì)的ADC；然而，為了消除對(duì)天然谷氨酰胺的非靶向偶聯(lián)，通過(guò)將Q295突變?yōu)樘於�酰胺獲得了最佳結(jié)果。

3.2.2 甲酰甘氨酸生成酶
FGE是一個(gè)廣泛分布的酶家族，催化I型硫酸酯酶活性位點(diǎn)內(nèi)半胱氨酸在翻譯過(guò)程中氧化為甲酰甘氨酸。半胱氨酸側(cè)鏈從─CH2SH轉(zhuǎn)化為─CH2CH═O對(duì)于細(xì)胞硫酸酯酶的活性至關(guān)重要。醛基提供了相對(duì)于20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的正交官能團(tuán)。哺乳動(dòng)物和細(xì)菌的FGE都識(shí)別一個(gè)五聚體CxPxR共有序列，該序列可以插入異源蛋白質(zhì)中。

FGE標(biāo)簽在插入抗體重鏈和輕鏈的內(nèi)部和羧基末端時(shí)都表現(xiàn)出耐受性。一種優(yōu)選方法是在重鏈羧基末端用SLCTPSRGS（FGE共有序列加粗）替換賴(lài)氨酸。為了補(bǔ)充內(nèi)源倉(cāng)鼠FGE，抗體重鏈和輕鏈在同時(shí)過(guò)表達(dá)人FGE的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中表達(dá)。含甲酰甘氨酸的抗體適合進(jìn)行經(jīng)典醛基反應(yīng)以形成肟和腙偶聯(lián)物。為了提高血漿穩(wěn)定性，已使用Pictet-Spengler、HIPS和trapped-Knoevenagel連接來(lái)生成抗體和藥物-連接子之間高度穩(wěn)定的C─C鍵。

曲妥珠單抗在重鏈羧基末端進(jìn)行了醛標(biāo)記，并與HIPS-谷氨酸-PEG2美登素藥物-連接子偶聯(lián)。通過(guò)疏水相互作用色譜去除未偶聯(lián)的單抗后，獲得了DAR為2的均質(zhì)ADC。與使用傳統(tǒng)賴(lài)氨酸化學(xué)制備的曲妥珠單抗-DM1（DAR=3.4）相比，該定點(diǎn)特異性ADC在體外細(xì)胞殺傷活性和對(duì)NCI-N87異種移植瘤的單次劑量體內(nèi)療效方面表現(xiàn)出相似或更好的效果。在小鼠中，定點(diǎn)特異性ADC的血清半衰期和暴露量比傳統(tǒng)ADC高30-40%，但低于未修飾的曲妥珠單抗。此外，在大鼠中以等效單次劑量給藥時(shí)，定點(diǎn)特異性ADC表現(xiàn)出比傳統(tǒng)ADC更低的毒性。正如預(yù)期，兩種ADC的毒性性質(zhì)相似。

3.2.3 葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和其他聚糖工程
Asn-297是人IgG恒定區(qū)內(nèi)N-連接糖基化的唯一規(guī)范位點(diǎn)。由于其遠(yuǎn)離抗原結(jié)合位點(diǎn)且對(duì)抗體藥代動(dòng)力學(xué)影響最小，聚糖是具有吸引力的偶聯(lián)位點(diǎn)。用高碘酸鹽氧化天然聚糖產(chǎn)生活性醛基是常見(jiàn)的方法；然而，反應(yīng)條件可能導(dǎo)致異質(zhì)混合物、蛋氨酸殘基氧化以及結(jié)合活性喪失。

SynAffix描述了一種三步程序，用于制備具有精確定義DAR值的聚糖偶聯(lián)ADC。在一個(gè)例子中，首先用內(nèi)切糖苷酶Endo S處理天然抗體，該酶切割N-連接聚糖，留下單個(gè)GlcNAc，如果存在則保留巖藻糖殘基。接下來(lái)，使用牛β(1-4)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的Y289L突變體將含疊氮的糖轉(zhuǎn)移到抗體上。然后通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)連接藥物-連接子，得到DAR=2的ADC。

Zhou等人描述了一種替代程序，即首先在UDP-半乳糖和CMP-唾液酸存在下，使用β(1-4)-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和α(2-6)-唾液酸轉(zhuǎn)移酶對(duì)抗體進(jìn)行唾液酸化。溫和的高碘酸鹽氧化后，含醛基的抗體通過(guò)肟化學(xué)進(jìn)行偶聯(lián)。使用這種方法，曲妥珠單抗與氨基氧基-Cys-mc-vc-PAB-MMAE藥物-連接子偶聯(lián)，生成DAR約2的ADC，該ADC包含具有0、1、2及更高DAR值的混合物。

Okeley等人描述了一種非酶促的代謝方法來(lái)改造抗體。將目標(biāo)抗體在有含硫醇巖藻糖類(lèi)似物的培養(yǎng)基中表達(dá)，該類(lèi)似物被整合到Asn-297聚糖中。游離硫醇使得能夠使用標(biāo)準(zhǔn)馬來(lái)酰亞胺化學(xué)與mc-vc-PAB-MMAE偶聯(lián)證實(shí)偶聯(lián)僅通過(guò)重鏈發(fā)生，得到的DAR約1.3。

3.3 非天然氨基酸和硒代半胱氨酸
另一種方法利用擴(kuò)展的遺傳密碼，該密碼包含相對(duì)于20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸具有正交反應(yīng)性的非天然氨基酸。在這種方法中，通過(guò)工程化的tRNA和氨酰-tRNA合成酶對(duì)，將琥珀終止密碼子重新定向以摻入非天然氨基酸。迄今為止，已有超過(guò)100種不同的非天然氨基酸被摻入蛋白質(zhì)中。這種方法已被用于在大腸桿菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中體外表達(dá)的抗體。盡管琥珀終止密碼子在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛使用，但從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中已能生產(chǎn)克/升級(jí)別的含非天然氨基酸的抗體。

曲妥珠單抗在重鏈A114位點(diǎn)用pAcF修飾，并通過(guò)含有三個(gè)乙二醇單元和非裂解連接子與MMAF偶聯(lián)。使用傳統(tǒng)馬來(lái)酰亞胺化學(xué)通過(guò)鏈間半胱氨酸將野生型曲妥珠單抗與MMAF偶聯(lián)作為對(duì)照。非天然氨基酸ADC和傳統(tǒng)ADC的DAR分別為2.0和3.8。盡管DAR較低，非天然氨基酸ADC在體外表現(xiàn)出與傳統(tǒng)ADC相當(dāng)?shù)募?xì)胞毒性，并且在NCI-N87和HCC-1954 Her2+異種移植模型中表現(xiàn)出相似或更好的療效。此外，在死亡率、體重、血液學(xué)和血清化學(xué)方面，非天然氨基酸ADC顯示出更好的耐受性�？傮w而言，與傳統(tǒng)ADC相比，非天然氨基酸ADC的治療窗口至少擴(kuò)大了兩倍，部分原因是其更優(yōu)的血漿穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)。

Sec通常被稱(chēng)為遺傳密碼中的"第21種氨基酸"，自然存在于約25種人類(lèi)蛋白質(zhì)中，其中許多充當(dāng)氧化還原酶。Sec在UGA終止密碼子處的摻入是通過(guò)專(zhuān)用的tRNA、3' sec插入序列和SECIS結(jié)合蛋白的協(xié)調(diào)作用實(shí)現(xiàn)的。與半胱氨酸相比，Sec在弱酸性pH值下比硫醇鹽對(duì)應(yīng)物更具反應(yīng)性的親核試劑，從而能夠選擇性標(biāo)記Sec。此外，與馬來(lái)酰亞胺硫醚鍵相比，與Sec的砜偶聯(lián)可以提供更好的血漿穩(wěn)定性。

3.4 替代形式和掩蔽抗體
全長(zhǎng)IgG具有血清半衰期長(zhǎng)、腎或肝膽清除有限以及免疫原性低的優(yōu)點(diǎn)。然而，與此形成鮮明對(duì)比的是，單鏈Fv、Fabs和其他較小的抗體支架仍然是臨床階段免疫毒素的主力，這些免疫毒素使用基于蛋白質(zhì)的毒素作為細(xì)胞毒性部分。靶向CD22和CD25的免疫毒素在不同類(lèi)型的白血病早期臨床研究中顯示出持久的反應(yīng)。較小的支架可以改善通常受擴(kuò)散限制的腫瘤滲透�？贵w的擴(kuò)散性被認(rèn)為與大小成反比，因此單鏈可變區(qū)片段抗體相對(duì)于全長(zhǎng)抗體具有約六倍的優(yōu)勢(shì)。此外，較小的結(jié)構(gòu)可以為定點(diǎn)偶聯(lián)提供更多機(jī)會(huì)。

這些構(gòu)建體包括scFvs、雙特異性抗體、Fabs和同源二聚體單鏈抗體。在每種情況下，都是通過(guò)表面暴露的半胱氨酸殘基實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)偶聯(lián)。Perrino等人測(cè)試了一種名為SIP(F8)-SS-DM1的ADC，其中抗體成分是一個(gè)靶向纖連蛋白剪接變體的同源二聚體"小免疫蛋白"。該ADC是一種非內(nèi)化ADC，設(shè)計(jì)用于結(jié)合腫瘤血管系統(tǒng)中的EDA，并在二硫鍵還原后在局部釋放高濃度DM1。在F9畸胎癌小鼠模型中，7 mg/kg q3dx3方案的耐受性良好，并伴有腫瘤完全消退。

在大多數(shù)情況下，實(shí)體瘤ADC面臨著靶點(diǎn)在正常組織上表達(dá)的挑戰(zhàn)。正常組織的表達(dá)可能導(dǎo)致劑量限制性的靶上毒性，或通過(guò)增加ADC在腫瘤外的攝取和有效載荷釋放而導(dǎo)致脫靶毒性。Probody™技術(shù)為緩解此問(wèn)題提供了一種方法。在Probody中，抗體輕鏈被修飾成包含一個(gè)氨基末端掩蔽肽和蛋白酶可裂解的連接子。掩蔽肽旨在阻斷正常組織中的抗原結(jié)合，但在腫瘤微環(huán)境中被蛋白酶釋放。在小鼠EGFR表達(dá)異種移植瘤模型中，野生型和Probody形式的西妥昔單抗顯示出相似的抗腫瘤療效。然而，在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中，Probody顯示出更好的安全性和循環(huán)半衰期。

3.5 ADC在腫瘤學(xué)以外適應(yīng)癥的應(yīng)用
除了Adcetris™在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中的探索性II期研究外，所有臨床階段的ADC都攜帶用于癌癥治療的細(xì)胞毒性有效載荷。從概念上講，細(xì)胞毒性ADC可以更廣泛地開(kāi)發(fā)用于腫瘤學(xué)以外的用途，之前在炎癥、感染和眼部疾病中對(duì)免疫毒素的臨床評(píng)估為此提供了先例。然而，更重要的是，抗體有潛力特異性遞送其他類(lèi)別的藥物，同樣的原理適用于將高活性化合物特異性遞送至目標(biāo)細(xì)胞，同時(shí)最大限度地減少對(duì)非靶細(xì)胞和組織的不良影響。為此，臨床前研究評(píng)估了靶向CD163+巨噬細(xì)胞的地塞米松、靶向人類(lèi)免疫缺陷病毒的CCR5拮抗劑、靶向CXCR4+造血細(xì)胞的多激酶抑制劑達(dá)沙替尼以及靶向CD11a+巨噬細(xì)胞的LXR激動(dòng)劑。

達(dá)沙替尼（圖10）通過(guò)抑制bcr-abl激酶，用于治療費(fèi)城染色體陽(yáng)性白血病。達(dá)沙替尼還抑制其他幾種激酶，包括介導(dǎo)T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的src家族成員lck和fyn。然而，作為游離藥物的達(dá)沙替尼的副作用譜阻礙了其作為免疫抑制劑的評(píng)估。CXCR4是一種趨化因子受體，在多種造血和非造血細(xì)胞類(lèi)型上表達(dá)。Wang等人使用基于二硫鍵和非裂解連接子（DAR約3）將達(dá)沙替尼與抗CXCR4和對(duì)照抗體偶聯(lián)。測(cè)試了這些ADC在抗CD3/抗CD28抗體刺激下對(duì)原代人T細(xì)胞分泌TNF-α和IL-2的影響。可裂解的抗CXCR4 ADC在13-27 nM濃度下阻斷50%的細(xì)胞因子分泌，而非結(jié)合ADC在200 nM時(shí)影響甚微。同樣，未偶聯(lián)的抗體和游離藥物-連接子在300 nM濃度下均無(wú)活性。需要進(jìn)一步研究以表征這些ADC在相關(guān)疾病模型中的安全性和有效性。

圖10 達(dá)沙替尼及其可裂解的基于達(dá)沙替尼的抗CXCR4 ADC的結(jié)構(gòu)（用于靶向免疫抑制）

基于LXR激動(dòng)劑在促進(jìn)巨噬細(xì)胞膽固醇流出方面的有益作用，人們一直在探索將其用于動(dòng)脈粥樣硬化治療。然而，這些藥物在肝臟中的不良靶向效應(yīng)阻礙了其臨床開(kāi)發(fā)。為了賦予巨噬細(xì)胞特異性，Lim等人將一種強(qiáng)效LXR激動(dòng)劑與抗CD11a抗體偶聯(lián)。CD11a是整合素LFA-1的α亞基，在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他白細(xì)胞上廣泛表達(dá)。如前所述，有效載荷通過(guò)定點(diǎn)特異性方式與已工程化含有非天然氨基酸pAcF的抗CD11a和對(duì)照抗體偶聯(lián)。與非結(jié)合對(duì)照ADC不同，抗CD11a ADC（圖11）特異性結(jié)合并被CD11a+ THP-1單核細(xì)胞（而非CD11a- HepG2肝癌細(xì)胞）內(nèi)化。抗CD11a ADC在THP-1（而非HepG2）報(bào)告細(xì)胞系中誘導(dǎo)了LXR驅(qū)動(dòng)的熒光素酶表達(dá)，而游離藥物在兩系中均有活性。

圖11 抗CD11a- LXR 激動(dòng)劑抗體偶聯(lián)藥物（ADC）結(jié)構(gòu)示意圖

4、 結(jié)論
抗體工程和藥物-連接子設(shè)計(jì)的單獨(dú)和協(xié)同創(chuàng)新，已在臨床前模型中顯著提高了腫瘤靶向ADC的活性廣度和治療窗口。另外，未來(lái)的方向可能包括增強(qiáng)效力、選擇性或內(nèi)化的雙特異性ADC、攜帶多類(lèi)藥物的ADC。此外，藥物分子可以被設(shè)計(jì)為在細(xì)胞外發(fā)揮作用，以實(shí)現(xiàn)靶向特異性或調(diào)節(jié)受體活性。ADC技術(shù)的快速發(fā)展與優(yōu)化，為改善多種人類(lèi)疾病的治療提供了新的方案。