利用AKTA系統(tǒng)進行TFF+多模態(tài)層析的大規(guī)模外泌體純化

直接作用于膜表面的溶液稱為進料液。沿著膜表面流動并回流至進料儲罐的溶液稱為滯留液。這種溶液通常會被泵送回原處并循環(huán)使用。穿過膜的溶液稱為透過液。

尺寸排阻層析 (SEC) 通常用于病毒或細胞外囊泡（EV 或外泌體）等大型敏感分子的下游處理。但此 SEC 步驟通常被視為生產(chǎn)瓶頸 — 低流速和有限的樣本上樣量可能會降低病毒和外泌體純化的速度。開發(fā) Capto™ Core 填料，旨在解決這一瓶頸并提高大分子的下游處理能力。Core填料是包含具有活化配基的核心層和外層非活性外殼的層析填料。這種結(jié)構(gòu)實現(xiàn)了雙功能作用，在內(nèi)捕獲較小的可通過外殼擴散的雜質(zhì)，而較大的目標分子可在流穿液中收集。通過組合尺寸排阻層析和結(jié)合層析模式，Capto™ Core 填料可作為 SEC 填料的優(yōu)先替代選擇，用于純化外泌體或其他大分子。

對于治療性外泌體，終產(chǎn)物的純度對于臨床應用與監(jiān)管至關重要。以外泌體為基礎的藥物成分的生產(chǎn)中需要去除的雜質(zhì)主要是細胞碎片、蛋白質(zhì)、宿主細胞DNA以及非外泌體的細胞外囊泡，比如凋亡小體和微囊泡。而外泌體的大小和理化性質(zhì)與脂蛋白、蛋白質(zhì)復合體和乳糜微粒等均有不同程度的重疊，這也為外泌體的分離與富集帶來了挑戰(zhàn)。

目前實驗室規(guī)模已有一些常用的外泌體純化方法，包括超速離心法、免疫分離法、聚合沉淀法、切向流過濾法、分子排阻層析法和微流體分離法等，但業(yè)內(nèi)對于大規(guī)模生產(chǎn)外泌體的分離純化工藝還沒有達成共識。這主要是因為并非所有方法都適用于大規(guī)模樣品的分離，而且不同方法也各有優(yōu)缺點，其分離純度與回收率都不盡相同。例如，最廣泛使用的超速離心法可以依據(jù)樣品大小與密度進行純化，但難以處理大批量樣本；免疫親和捕獲獲取的外泌體純度較高，但只能特異性富集表達某幾種特異性表面蛋白質(zhì)的外泌體；微流體法操作簡單，處理速度快，但依舊只適合少量樣本的提取。最近的研究表明，切向流過濾和分子排阻層析法（單獨或聯(lián)合）可以在大規(guī)模外泌體純化中發(fā)揮作用。

分子排阻層析利用外泌體和樣品中其它成分在分子大小上的差異進行分離，這一方法可以保持樣品的完整性和生物活性，而且可以很好地進行放大，有能力對大量樣品進行處理。有很多研究都使用這一技術成功對外泌體進行了分離純化，然而，這一方法也有其劣勢，流速較慢、上樣量受到體積限制、樣品純度有待進一步提高等。

基于這一現(xiàn)狀，多模式層析填料Cytiva Capto core 700成為外泌體領域備受喜愛的新寵。Capto core 700由配基活化核心和5 μm惰性外殼組成，惰性外殼不允許超過700kDa的大分子進入核內(nèi)，而外泌體樣品中的小分子，比如宿主細胞蛋白、DNA片段等，進入核內(nèi)后，與兼具陰離子交換和疏水作用的辛胺基團結(jié)合，從而達到分離目的。這一多模式填料通過流穿模式分離外泌體樣品，上樣量更高，而且新一代的Capto基架滿足高流速的要求，高效捕獲污染物的同時節(jié)省操作時間。

Ryan等人在進行大規(guī)模外泌體純化的研究時，利用切向流過濾結(jié)合PEG沉淀技術以及Capto core 700層析完成了細胞培養(yǎng)上清和血漿不同樣品中外泌體的分離。在完成前處理后，利用ÄKTA Flux S系統(tǒng)，使用750kDa中空纖維濾柱（UFP-750-E-4X2MA，Cytiva）對樣品進行約10倍的超濾濃縮，去除小分子雜質(zhì)的同時進行換液。隨后的RNaseA處理、PEG沉淀和一步Capto core 700層析提高了外泌體純度以及同質(zhì)性。他們的實驗數(shù)據(jù)表明，這一方法與單純的超速離心和PEG沉淀相比，得到了更高濃度的外泌體產(chǎn)品，且大小分布更均勻，具有相應生物活性。

ÄKTA flux™過濾系統(tǒng)是一種多功能的切向流過濾(TFF)系統(tǒng)，用于樣品濃縮和隔層過濾(緩沖液交換)，以及細抱采集和澄清。該系統(tǒng)允許使用盒式過濾器空心纖維濾芯和膜吸附器進行輕松過濾。ÄKTA flux™系統(tǒng)有兩個版本:用于研究、過濾篩分和小規(guī)模生產(chǎn)的ÄKTA flux™s系統(tǒng)，以及用于工藝開發(fā)和小規(guī)模生產(chǎn)的ÄKTA flux™6系統(tǒng)。半自動化功能可實現(xiàn)端點控制、恒定保留容積(CRV)和數(shù)據(jù)記錄。這些功能可以騰出時間用于實驗室的其他任務。通過易于使用的觸摸屏，可以方便地監(jiān)控和處理工藝信息和控制。該系統(tǒng)可以處理較低的工作量，以支持廣泛的濃度因子。ÄKTA flux™過濾系統(tǒng)非常適合用于蛋白質(zhì)純化和澄清，作為AKTA的補充層析系統(tǒng)。

低工作體積支持廣泛的濃度因子。

自動終點控制和數(shù)據(jù)記錄可釋放實驗室中其他任務的時間。

靈活的操作方式支持同時使用中空纖維濾芯和卡盒。

多功能設計支持超濾和微濾應用。

易于使用的操作界面簡化了系統(tǒng)操作。AKTA fux6系統(tǒng)適用于GMP監(jiān)管環(huán)境，支持符合21CFR第11部分的要求。

綜合上述分析與實驗驗證，AKTA系統(tǒng)憑借其完善的技術配置與靈活的應用能力，無疑為TFF與多模態(tài)層析聯(lián)合實現(xiàn)大規(guī)模外泌體純化提供了可靠支撐。ÄKTA flux系列切向流過濾系統(tǒng)通過高效的超濾濃縮、換液與雜質(zhì)初步去除，為后續(xù)純化奠定了優(yōu)質(zhì)樣品基礎，其低工作體積、自動化控制等優(yōu)勢適配大規(guī)模處理需求；而Cytiva Capto Core系列多模態(tài)層析填料作為核心分離單元，與AKTA系統(tǒng)無縫兼容，以流穿模式實現(xiàn)外泌體與小分子雜質(zhì)的高效分離，解決了傳統(tǒng)方法流速慢、上樣量有限的瓶頸。Ryan等人的研究已明確證實，依托ÄKTA Flux S系統(tǒng)的TFF工藝與Capto Core 700層析的聯(lián)合應用，能夠高效獲得高濃度、高同質(zhì)性且保留生物活性的外泌體產(chǎn)品，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)純化手段。在治療性外泌體對純度與規(guī)模化生產(chǎn)的雙重要求下，AKTA系統(tǒng)所支撐的TFF+多模態(tài)層析技術，不僅突破了現(xiàn)有工藝的局限，更為外泌體的臨床轉(zhuǎn)化與產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了堅實的技術保障，成為大規(guī)模外泌體純化領域極具應用價值的優(yōu)選方案。