為何選TFF+SEC工藝：外泌體純化核心優(yōu)勢及思拓凡CAP™應用案例

切向流過濾（TFF）和尺寸排阻色譜（SEC）是兩種常用于從復雜生物流體中富集外泌體的方法。結(jié)合這些著名的技術（它們是溫和的外泌體純化方法），可以去除大部分宿主細胞蛋白（HCP）和DNA。此外，這種工作流程回收率高，并能最大限度地減少純化外泌體生物活性的損失。

已知在不同培養(yǎng)基和條件下培養(yǎng)的不同細胞類型所產(chǎn)生的外泌體，會呈現(xiàn)出不同的糖基化模式和表面蛋白——這不僅會影響其生物活性，還會影響外泌體與過濾膜和層析樹脂的相互作用。我們?yōu)槿�種細胞系開發(fā)了一種溫和且可擴展的工作流程，并在思拓凡的羊水細胞生產(chǎn)細胞（CAP™）的結(jié)果進行了評估：

在該工作流程中，使用了Cytiva的羊膜細胞生產(chǎn)（CAP™）細胞系來生產(chǎn)外泌體，這些外泌體表面有與CD63相連的綠色熒光蛋白（GFP）標簽，用于熒光檢測。為了確定TFF-SEC方案的可重復性，對GFP-外泌體CAP™條件培養(yǎng)基上清進行了兩次獨立的富集，先采用TFF，再通過superSEC樹脂進行純化。與實施例1相同，進行了兩種規(guī)模的純化——兩個HiScreen™柱，以及一個床高為20厘米的HiScale™ 26/40柱，詳見材料和方法中的表1。對回收率和外泌體濃度進行了測量，包括顆粒數(shù)（NTA）、CD63（ELISA）、總蛋白和單鏈DNA含量分析。通過蛋白質(zhì)印跡（Wb）和掃描電子顯微鏡（SEM）對收集到的組分中的顆粒進行了最終鑒定確認。

將250毫升CAP™ CCS的樣品負荷施加到TFF中空纖維膜（截留分子量750 kDa）上，進行過濾。TFF步驟后收集了25毫升樣品。大約97%的DNA和92%的蛋白質(zhì)被去除。根據(jù)納米顆粒跟蹤分析（NTA），TFF后保留的顆粒產(chǎn)量為初始顆粒濃度的56%。通過CD63酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）分析，外泌體回收率為43%。

然后將TFF保留物上樣到色譜柱中——1毫升上樣到HiScreen™ superSEC色譜柱，15毫升上樣到HiScale™色譜柱。色譜圖如圖7所示。490納米吸光度曲線顯示，GFP外泌體在兩種色譜柱形式中均在第一個峰中洗脫出來，且在第二個峰中未檢測到490納米吸光度。HiScreen™和HiScale™ superSEC色譜柱的運行時間分別為20分鐘（流速129厘米/小時）和45分鐘（流速45厘米/小時）。算上色譜柱的平衡和清洗時間，一次運行的總時間分別為1小時和2小時。

HiScale™層析柱運行結(jié)果證實，外泌體和蛋白質(zhì)污染物也能在更大規(guī)模下實現(xiàn)分離。切向流過濾（TFF）過程中的核酸酶處理是有效的，且能改善宿主DNA的去除效果——采用核酸酶處理的TFF步驟后，外泌體樣品中97%的DNA殘留被去除，而未使用核酸酶時僅能去除40%。superSEC樹脂純化步驟進一步提高了外泌體組分中DNA的去除率，這證實superSEC可作為外泌體純化第二步的有效替代方法。納米顆粒追蹤分析（NTA）還顯示，在整個過程中，顆粒的平均尺寸（150至160納米）沒有變化。

為進一步確認所收集的組分中存在外泌體，我們使用CD81和TSG101抗體進行了蛋白質(zhì)印跡（Wb）分析，并通過掃描電子顯微鏡（SEM）進行了電鏡分析。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果證實，這些囊泡表達CD81和TSG101，不過TSG101僅在切向流過濾（TFF）截留物中被檢測到，這可能是由于體積排阻色譜（SEC）組分中的濃度較低。

掃描電鏡分析圖像顯示存在具有典型杯狀形態(tài)的囊泡，且TFF-SEC流程去除了雜質(zhì)。

綜上，TFF與SEC工藝的組合憑借溫和性、高效除雜能力、高回收率、良好可擴展性及對生物活性的保留優(yōu)勢，成為外泌體純化的優(yōu)選方案，完美契合外泌體功能研究、臨床應用及規(guī)�；�生產(chǎn)的核心需求。思拓凡（Cytiva）已成功將該工藝應用于CAP™細胞系產(chǎn)生的GFP外泌體純化，通過實際應用驗證了其在不同規(guī)模下的穩(wěn)定性與可靠性。隨著外泌體技術在生物醫(yī)學領域的深入發(fā)展，TFF+SEC組合工藝將持續(xù)為各類細胞系來源外泌體的高效純化提供有力支撐，推動外泌體從實驗室研究走向更廣泛的臨床轉(zhuǎn)化與產(chǎn)業(yè)化應用。