染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）技術(shù)的原理及實(shí)驗(yàn)步驟深度揭秘
簡(jiǎn)介
染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)，是表觀遺傳學(xué)研究里的 “明星方法”，能快速鎖定蛋白質(zhì)和 DNA 的結(jié)合位點(diǎn)，揭開(kāi)二者互作的神秘面紗。
染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)，是表觀遺傳學(xué)研究里的 “明星方法”，能快速鎖定蛋白質(zhì)和 DNA 的結(jié)合位點(diǎn)，揭開(kāi)二者互作的神秘面紗。
這項(xiàng)技術(shù)的底層邏輯是抗原抗體的特異性識(shí)別：用特定抗體 “釣取” 目標(biāo) DNA 結(jié)合蛋白，同時(shí)把它結(jié)合的 DNA 片段一起富集起來(lái)，最終就能在全基因組層面，搞清楚細(xì)胞或組織里蛋白質(zhì)和 DNA 到底是怎么 “互動(dòng)” 的。
技術(shù)原理
ChIP 技術(shù)的關(guān)鍵在于 “鎖住” 蛋白質(zhì)和 DNA 的真實(shí)結(jié)合狀態(tài)：先在細(xì)胞正常生長(zhǎng)的條件下，用化學(xué)試劑把 DNA 和結(jié)合在上面的蛋白質(zhì) “粘” 在一起，避免后續(xù)操作中二者分離；接著用超聲或酶把纏結(jié)的染色質(zhì)剪成小段，方便后續(xù)精準(zhǔn)篩選；再用專門識(shí)別目的蛋白的抗體，把 “蛋白 - DNA” 復(fù)合物 “抓” 出來(lái)，實(shí)現(xiàn)特異性富集。
整個(gè)實(shí)驗(yàn)要經(jīng)過(guò)細(xì)胞固定、染色質(zhì)剪碎、免疫沉淀、解除交聯(lián)、DNA 提純、DNA 檢測(cè)這幾步。不過(guò)因?yàn)椴襟E多、每一步的操作細(xì)節(jié)都容易影響結(jié)果，所以做實(shí)驗(yàn)時(shí)一定要設(shè)置對(duì)照，而且得結(jié)合經(jīng)驗(yàn)判斷結(jié)果是否可靠，這樣才能避免實(shí)驗(yàn)白做。
研究意義
實(shí)驗(yàn)材料
一、核心器材
二、試劑與耗材
核酸與蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的核心生物大分子，二者之間的動(dòng)態(tài)相互作用是調(diào)控各類生命進(jìn)程的基礎(chǔ)，貫穿細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、遺傳信息傳遞及代謝穩(wěn)態(tài)維持等關(guān)鍵生理過(guò)程。深入解析蛋白質(zhì)與核酸的互作機(jī)制，是揭開(kāi)生命現(xiàn)象本質(zhì)、闡明疾病發(fā)生發(fā)展分子機(jī)理的核心突破口。而染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）技術(shù)，憑借其能在生理狀態(tài)下捕獲蛋白質(zhì)與DNA天然結(jié)合狀態(tài)的優(yōu)勢(shì)，成為表觀遺傳學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域中，研究蛋白質(zhì)-DNA互作關(guān)系、挖掘基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心工具，為疾病機(jī)制研究、藥物靶點(diǎn)篩選等提供了重要技術(shù)支撐。
一、核心器材
靜音混合器、高速低溫離心機(jī)、超聲破碎儀、電泳儀、水平電泳槽、普通PCR儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Real-time PCR儀）。
1. 細(xì)胞樣本：HeLa細(xì)胞；
2. 緩沖液及基礎(chǔ)試劑：HEPES、NaCl、KOH、HCl、Triton X-100、NP-40、十二烷基硫酸鈉（SDS）、NaHCO₃、去氧膽酸鈉、乙二胺四乙酸（EDTA）、Tris緩沖液、蛋白酶抑制劑混合物、蛋白酶K；
3. 免疫沉淀相關(guān)試劑：Protein A/G磁珠（預(yù)結(jié)合鮭精DNA封閉）；
4. 對(duì)照及檢測(cè)試劑：GAPDH對(duì)照引物、陽(yáng)性對(duì)照抗體（乙�；M蛋白H3抗體，Anti-Acetyl Histone H3）、陰性對(duì)照抗體（正常家兔IgG，Normal IgG）；
5. 核酸檢測(cè)試劑：瓊脂糖、PCR反應(yīng)Mix、SYBR Green qPCR Mix。
三、實(shí)驗(yàn)步驟
（二）細(xì)胞固定
ChIP實(shí)驗(yàn)核心流程可分為試劑配制、細(xì)胞固定、染色質(zhì)斷裂、免疫沉淀等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其中試劑配制與細(xì)胞固定是保障實(shí)驗(yàn)成功的基礎(chǔ)，具體操作如下：
（一）試劑配制
所有緩沖液需提前配制并調(diào)節(jié)至對(duì)應(yīng)pH值，蛋白酶抑制劑需臨用前新鮮加入，避免酶解目標(biāo)蛋白，具體配方如下：
（1）裂解緩沖液（FA Lysis Buffer）：50 mmol／L HEPES-KOH（pH 7.5）、140 mmol/L NaCl、1 mmol/L EDTA（pH 8.0）、1％ Triton X-100、0.1％ 去氧膽酸鈉、0.1％ SDS，臨用前加入適量蛋白酶抑制劑。
（2）RIPA緩沖液：50 mmol／L Tris-HCl（pH 8.0）、150 mmol/L NaCl、2 mmol/L EDTA（pH 8.0）、1% NP-40、0.5％ 去氧膽酸鈉、0.1％ SDS，臨用前加入適量蛋白酶抑制劑。
（3）漂洗緩沖液（Wash Buffer）：0.1％ SDS、1％ Triton X-100、2 mmol/L EDTA（pH 8.0）、150 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）。
（4）最終漂洗緩沖液（Final Wash Buffer）：0.1％ SDS、1% Triton X-100、2 mmol/L EDTA（pH 8.0）、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）。
細(xì)胞固定的核心是在生理狀態(tài)下交聯(lián)DNA與蛋白質(zhì)，維持二者天然結(jié)合狀態(tài)，操作需輕柔以避免細(xì)胞破裂，步驟如下：
（1）取直徑150 mm培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞匯合度達(dá)80%~90%（細(xì)胞數(shù)量約1×10⁷個(gè)）時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；向培養(yǎng)皿中20 ml培養(yǎng)基內(nèi)，加入550 μl 37%甲醛（或1100 μl 18.5%甲醛），使甲醛終濃度為1%。
（2）輕柔晃動(dòng)培養(yǎng)皿混勻，室溫孵育10 min，確保交聯(lián)充分且均勻。
（3）終止交聯(lián)：加入甘氨酸至終濃度125 mmol／L，輕柔混勻后室溫孵育5 min，徹底終止甲醛的交聯(lián)作用。
（4）將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至冰上預(yù)冷，抑制細(xì)胞內(nèi)源性酶活性，防止目標(biāo)復(fù)合物降解。
（5）小心吸盡培養(yǎng)基，加入20 ml冰冷的PBS，輕柔清洗細(xì)胞表面殘留培養(yǎng)基及試劑。
（6）吸盡PBS，重復(fù)上述PBS清洗步驟1次，確保清洗徹底。
（7）加入2 ml含1×蛋白酶抑制劑復(fù)合物的冰冷PBS，用細(xì)胞刮刀沿培養(yǎng)皿壁輕柔刮取細(xì)胞，收集至1.5 ml離心管中。
（8）置于高速低溫離心機(jī)，1000 g、4 ℃條件下離心5 min，收集細(xì)胞沉淀。
（9）吸棄上清液，向細(xì)胞沉淀中加入750 μl預(yù)冷的FA Lysis緩沖液，輕柔吹打重懸細(xì)胞，獲得細(xì)胞裂解液，后續(xù)用于染色質(zhì)斷裂步驟。
（三）染色質(zhì)斷裂
（四）染色質(zhì)免疫沉淀
（五）解交聯(lián)反應(yīng)和DNA的純化
（六）DNA的鑒定
（七）實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析
注意事項(xiàng)
（1）將含細(xì)胞裂解液的離心管置于冰上，進(jìn)行超聲破碎。超聲參數(shù)設(shè)定為：功率310 W，沖擊20 s，間隔2 s，共進(jìn)行3個(gè)循環(huán)。需注意，超聲條件具有細(xì)胞系特異性，且與細(xì)胞數(shù)量密切相關(guān)，需通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索確定最優(yōu)條件。超聲過(guò)程中，將探頭盡量深入管內(nèi)，但避免接觸管底及側(cè)壁，防止產(chǎn)生泡沫影響實(shí)驗(yàn)效果。
（2）超聲破碎完成后，于4 ℃、10,000 g條件下離心10 min，去除細(xì)胞碎片等不溶性雜質(zhì)。
（3）小心吸取上清液，分裝至新的1.5 ml離心管中，每管50 μl，分裝后可置于-80 ℃冰箱保存，保存期最長(zhǎng)不超過(guò)3個(gè)月。
（4）取100 μl超聲破碎產(chǎn)物，加入5 μl濃度為20 mg/ml的蛋白酶K，于65 ℃條件下旋轉(zhuǎn)混勻，進(jìn)行解交聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為4~5 h（或過(guò)夜）。反應(yīng)結(jié)束后，取一半樣品進(jìn)行酚-氯仿抽提，后續(xù)通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)超聲破碎效果，確保染色質(zhì)片段符合實(shí)驗(yàn)要求。
（1）將每管50 μl的超聲破碎產(chǎn)物按1:10比例稀釋，加入450 μl RIPA緩沖液，輕輕混勻。從中吸取5 μl（占總體積的1%）作為Input對(duì)照，置于4 ℃保存，備用（用于后續(xù)第4步驗(yàn)證）。
（2）向每個(gè)樣品管中分別加入陽(yáng)性對(duì)照抗體、陰性對(duì)照抗體（正常IgG）及目標(biāo)蛋白抗體，抗體用量范圍為1~10 μg。由于抗體的效力、純度及特異性存在差異，建議通過(guò)抗體梯度稀釋實(shí)驗(yàn)，確定該實(shí)驗(yàn)體系的最適抗體用量。
（3）向各管中加入20 μl充分混勻的Protein A／G beads（預(yù)結(jié)合鮭魚精DNA，Salmon Sperm DNA），輕柔混勻。
（4）置于4 ℃環(huán)境中旋轉(zhuǎn)孵育1 h（或過(guò)夜），確�？贵w與抗原及beads充分結(jié)合形成免疫復(fù)合物。
（5）孵育結(jié)束后，于2000 g條件下離心1 min，小心棄去上清液，保留beads復(fù)合物。
（6）用1 ml Wash緩沖液清洗beads，共清洗3次，每次清洗后于2000 g離心1 min，棄去上清液，徹底去除未結(jié)合的雜蛋白及雜質(zhì)。
（7）最后用1 ml Final Wash緩沖液清洗beads 1次，2000 g離心1 min，棄去上清液，完成beads純化。
通過(guò)蛋白酶K介導(dǎo)的解交聯(lián)反應(yīng)釋放結(jié)合的DNA，隨后采用酚-氯仿抽提結(jié)合乙醇沉淀法純化DNA，或直接使用DNA純化柱回收DNA，具體步驟如下：
（1）向每份樣品（含Input對(duì)照組）中加入120 μl Elution緩沖液，置于30 ℃環(huán)境中旋轉(zhuǎn)孵育15 min，使DNA從免疫復(fù)合物中洗脫。
（2）于2000 g條件下離心1 min，收集上清液。
（3）將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，可暫時(shí)置于-20 ℃保存。
（4）向各管中加入5 μl濃度為20 mg/ml的蛋白酶K，65 ℃條件下旋轉(zhuǎn)混勻，進(jìn)行二次解交聯(lián)反應(yīng)，時(shí)長(zhǎng)4~5 h（或過(guò)夜），確保交聯(lián)完全解除。
（5）對(duì)解交聯(lián)后的樣品進(jìn)行酚-氯仿抽提，后續(xù)通過(guò)乙醇沉淀法純化DNA，純化后加入100 μl無(wú)菌水溶解DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/span>
ChIP實(shí)驗(yàn)回收DNA的常用鑒定方法為半定量PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR），可通過(guò)擴(kuò)增特異性靶序列驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)有效性及富集效率。
（1）交聯(lián)后的染色質(zhì)經(jīng)超聲斷裂后，通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，合格的破碎效果應(yīng)滿足：染色質(zhì)片段平均長(zhǎng)度在200~1000 bp之間，片段分布均勻，無(wú)明顯拖尾或大片段殘留。
（2）對(duì)純化后的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，選取管家基因GAPDH的啟動(dòng)子區(qū)作為擴(kuò)增靶序列（擴(kuò)增片段大小為165 bp）。理想結(jié)果為：陽(yáng)性對(duì)照及Input對(duì)照均能檢測(cè)到清晰的擴(kuò)增條帶，無(wú)DNA模板的空白對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶，陰性對(duì)照（正常IgG）可出現(xiàn)微弱擴(kuò)增條帶，但條帶亮度與陽(yáng)性對(duì)照存在顯著差異，表明實(shí)驗(yàn)特異性良好。
（1）甲醛交聯(lián)時(shí)間需通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，因其受細(xì)胞類型、細(xì)胞數(shù)量影響較大。交聯(lián)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)材料丟失，且增加超聲破碎難度；交聯(lián)時(shí)間過(guò)短則會(huì)造成交聯(lián)不完全，影響免疫沉淀效果。
（2）超聲破碎通過(guò)機(jī)械力斷裂染色質(zhì)，過(guò)程中易產(chǎn)生熱量及泡沫，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，降低ChIP效率。因此，超聲操作需全程在冰上進(jìn)行，采用時(shí)斷時(shí)續(xù)的超聲程序，避免長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)超聲，防止蛋白質(zhì)降解及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞。
（3）ChIP實(shí)驗(yàn)需設(shè)置完善的對(duì)照體系，缺少對(duì)照會(huì)無(wú)法評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。陽(yáng)性抗體對(duì)照、陰性抗體（正常IgG）對(duì)照為基礎(chǔ)對(duì)照；Input對(duì)照不僅可驗(yàn)證染色質(zhì)破碎效果，還能根據(jù)Input及沉淀樣品中靶序列的含量，按取樣比例計(jì)算ChIP富集效率，是實(shí)驗(yàn)有效性驗(yàn)證的關(guān)鍵。
（4）目標(biāo)蛋白抗體的選擇是ChIP實(shí)驗(yàn)成功的核心。蛋白質(zhì)與染色質(zhì)交聯(lián)后，抗體的抗原表位可能被掩蓋（與染色質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)過(guò)近），導(dǎo)致抗體無(wú)法識(shí)別，影響免疫復(fù)合物形成。因此，并非所有抗體均適用于ChIP實(shí)驗(yàn)，需選用經(jīng)ChIP實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證合格的抗體，以保障實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
樂(lè)備實(shí)（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司旗下全資子公司），是國(guó)內(nèi)專注于提供高質(zhì)量蛋白檢測(cè)以及組學(xué)分析服務(wù)的實(shí)驗(yàn)服務(wù)專家，自2018年成立以來(lái)，樂(lè)備實(shí)不斷尋求突破，公司的服務(wù)技術(shù)平臺(tái)已擴(kuò)展到單細(xì)胞測(cè)序、空間多組學(xué)、流式檢測(cè)、超敏電化學(xué)發(fā)光、Luminex多因子檢測(cè)、抗體芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫組化、DSP空間多組學(xué)等30多個(gè)，建立起了一套涵蓋基因、蛋白、細(xì)胞以及組織水平實(shí)驗(yàn)的完整檢測(cè)體系。
樂(lè)備實(shí)（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司旗下全資子公司），是國(guó)內(nèi)專注于提供高質(zhì)量蛋白檢測(cè)以及組學(xué)分析服務(wù)的實(shí)驗(yàn)服務(wù)專家，自2018年成立以來(lái)，樂(lè)備實(shí)不斷尋求突破，公司的服務(wù)技術(shù)平臺(tái)已擴(kuò)展到單細(xì)胞測(cè)序、空間多組學(xué)、流式檢測(cè)、超敏電化學(xué)發(fā)光、Luminex多因子檢測(cè)、抗體芯片、PCR Array、ELISA、Elispot、PLA蛋白互作、多色免疫組化、DSP空間多組學(xué)等30多個(gè)，建立起了一套涵蓋基因、蛋白、細(xì)胞以及組織水平實(shí)驗(yàn)的完整檢測(cè)體系。
標(biāo)簽：
ChIP
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