多組學(xué)聯(lián)合分析揭示口腔癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的免疫抑制微環(huán)境與治療新策略

期刊：Clinical and Translational Medicine
影響因子：6.8
通訊作者：蘇宇雄、張高
通訊單位：香港大學(xué)
伯豪技術(shù)服務(wù)+產(chǎn)品：snRNA+空間轉(zhuǎn)錄組+轉(zhuǎn)錄組、伯優(yōu)®細(xì)胞核分離試劑盒

科學(xué)問題
口腔鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)重塑與免疫抑制如何協(xié)同驅(qū)動癌細(xì)胞擴散，其分子機制與關(guān)鍵靶點是什么？

實驗材料和方法
1.患者隊列與樣本處理
分組：pLN⁺（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，n=10） vs pLN⁻（無轉(zhuǎn)移，n=36）
樣本類型：新鮮冷凍組織、FFPE切片、配對血液樣本
2.多組學(xué)數(shù)據(jù)

主要產(chǎn)品

導(dǎo)語
香港大學(xué)蘇宇雄教授、張高教授團(tuán)隊在一項具有里程碑意義的口腔鱗癌研究中，借助伯優(yōu)細(xì)胞核分離試劑盒提供的穩(wěn)定、高質(zhì)量的細(xì)胞核制備，成功對46例原發(fā)腫瘤（含10例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性樣本）進(jìn)行了系統(tǒng)性多組學(xué)整合分析，首次構(gòu)建了涵蓋基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、表觀基因組、單細(xì)胞及空間轉(zhuǎn)錄組的全維度分子圖譜。該研究不僅揭示了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的關(guān)鍵突變譜、細(xì)胞外基質(zhì)重塑和免疫抑制微環(huán)境特征，更通過單細(xì)胞與空間技術(shù)，清晰解析了癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）通過分泌TGF-β配體激活癌細(xì)胞內(nèi)信號、驅(qū)動上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的空間協(xié)作機制。這些多層次的發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)闡明了口腔癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的驅(qū)動網(wǎng)絡(luò)，為早期識別高�；颊呒伴_發(fā)靶向治療策略提供了全新依據(jù)，也凸顯了可靠的上游工具對推動前沿癌癥研究的關(guān)鍵價值。

主要產(chǎn)品
snRNA+空間轉(zhuǎn)錄組+轉(zhuǎn)錄組、伯優(yōu)®細(xì)胞核分離試劑盒
（技術(shù)服務(wù)產(chǎn)品伯豪生物提供）

研究結(jié)果
1. 基因組層面：揭示pLN+的獨特通路擾動
通過對pLN+和pLN−腫瘤的WES數(shù)據(jù)分析，研究發(fā)現(xiàn)兩組的腫瘤突變負(fù)荷（TMB）和瘤內(nèi)異質(zhì)性（ITH）無顯著差異（Figure S2A, B）。盡管TP53、TTN、CDKN2A等經(jīng)典腫瘤驅(qū)動基因在兩組中均有高頻突變，但通路擾動分析（PMP評分）揭示了關(guān)鍵區(qū)別（Figure 2G）。

pLN+特異性通路：顯著富集于“病毒蛋白與細(xì)胞因子/受體互作”通路，病毒模擬或細(xì)胞因子信號異�？赡茉趐LN+的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。

pLN−富集通路：包括鈣信號、B細(xì)胞受體、胰島素和雌激素信號通路，這些通路的活躍可能與相對局限的腫瘤表型有關(guān)。

此外，在pLN+組中，與DNA修復(fù)（FANCA）、組蛋白修飾（KMT2A）、TGF-β（LTBP1）及MAPK（MAP3K14, MAPK1）等通路相關(guān)的基因突變更為突出（Figure 2D）。這些發(fā)現(xiàn)表明，pLN+腫瘤在獲得性突變上已偏向于涉及基質(zhì)互作、細(xì)胞可塑性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的特定通路。

圖2 伴有或不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)性O(shè)SCC的基因組圖譜

2. 轉(zhuǎn)錄組與蛋白質(zhì)組：共同指向ECM重塑與免疫抑制表型
轉(zhuǎn)錄組分析（Figure 3A-C）顯示，與pLN−腫瘤相比，pLN+腫瘤顯著上調(diào)了包括TGFBI、AGR2和AURKA在內(nèi)的基因。GSEA分析進(jìn)一步證實，pLN+腫瘤的特征是細(xì)胞周期（G2/M檢查點、E2F靶基因）和DNA修復(fù)通路的強烈激活，而pLN−腫瘤則富集于角質(zhì)化和脂代謝相關(guān)通路（Figure 3B）。尤為重要的是，免疫浸潤分析（CIBERSORTx, xCell）結(jié)合免疫特征基因集富集發(fā)現(xiàn)，pLN+腫瘤表現(xiàn)出Th2細(xì)胞特征上調(diào)和免疫抑制相關(guān)（如 naïve CD4+ T細(xì)胞特征），這支持了pLN+ OSCC具有“免疫抑制”表型的假說（Figure 3A）。

圖3 pLN+與pLN−組的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征

4D-DIA蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)（Figure 4, S5）不僅驗證了TGFBI等mRNA水平的變化，更通過加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）發(fā)現(xiàn)了關(guān)鍵功能模塊。在31個共表達(dá)模塊中，ME11模塊被鑒定為ECM相關(guān)核心模塊，其蛋白（如FN1, POSTN, LUM, COL6A2, BGN）在pLN+腫瘤中高表達(dá)，且與患者不良預(yù)后、高復(fù)發(fā)風(fēng)險和低分化等級顯著相關(guān)（Figure 4E, F）。通路富集分析同樣確認(rèn)，ECM組織和整合素互作是pLN+腫瘤蛋白質(zhì)組的標(biāo)志性特征。

圖4 蛋白質(zhì)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及功能蛋白模塊的臨床相關(guān)性

通過整合mRNA與蛋白質(zhì)表達(dá)譜的關(guān)聯(lián)分析（Figure 5A-C, G），研究精準(zhǔn)鎖定了一個在pLN+腫瘤中一致性上調(diào)的關(guān)鍵樞紐分子——POSTN (Periostin)。其表達(dá)在轉(zhuǎn)錄與翻譯水平均顯著升高，且高表達(dá)與患者較差的總生存期明確相關(guān)。作為公認(rèn)的基質(zhì)細(xì)胞蛋白，POSTN是驅(qū)動細(xì)胞外基質(zhì)組裝并激活WNT、NOTCH等多條促瘤通路的核心因子。本研究中其樞紐地位的實驗確認(rèn)，從分子互作層面將POSTN置于連接“ECM重塑-信號通路激活-患者不良預(yù)后”這一網(wǎng)絡(luò)的核心，為理解pLN+腫瘤的進(jìn)展提供了關(guān)鍵錨點。

圖5 批量腫瘤測序平臺的整合分析

3. 表觀基因組：EGFR通路的去甲基化激活
表觀基因組分析進(jìn)一步揭示了pLN+腫瘤的調(diào)控異常。DNA甲基化數(shù)據(jù)（Figure S6）顯示，pLN+腫瘤中EGFR基因啟動子區(qū)域呈現(xiàn)特異性低甲基化。這種常見的激活型表觀遺傳修飾，通常導(dǎo)致EGFR轉(zhuǎn)錄活性增強，可能進(jìn)而持續(xù)激活其下游的MAPK等促增殖與存活信號通路，從表觀遺傳層面為pLN+腫瘤的高侵襲性提供了機制補充。

4. 單細(xì)胞與空間解析：CAF通過TGF-β“教育”腫瘤細(xì)胞
首先，單細(xì)胞圖譜明確了關(guān)鍵信號的細(xì)胞來源。 通過對4例OSCC樣本的22，433個細(xì)胞核進(jìn)行分析，我們成功繪制了TME的細(xì)胞圖譜，鑒定出上皮細(xì)胞、癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和神經(jīng)元等主要群體（Figure 6A, B）。重要的是，表達(dá)分析顯示，在蛋白質(zhì)組學(xué)中鑒定的核心基質(zhì)蛋白POSTN主要在CAFs中高表達(dá)，而促轉(zhuǎn)移信號分子TGF-β1/2也顯著富集于CAFs（Figure 6C, D; Figure S8C）。

其次，我們精準(zhǔn)識別出與轉(zhuǎn)移表型共存的腫瘤細(xì)胞亞群。 利用拷貝數(shù)變異分析，我們從上皮細(xì)胞中鑒定出5，099個腫瘤細(xì)胞，并劃分為5個亞群（C0-C4）。分布分析顯示，pLN+腫瘤主要由C0和C1亞群主導(dǎo)，而pLN−腫瘤則富含其他亞群（Figure 6E）。這兩個優(yōu)勢亞群表現(xiàn)出獨特的“TGF-βI陽性”表型：它們不僅高表達(dá)TGFBI基因，還富集于上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和細(xì)胞周期（G2/M檢查點， E2F靶標(biāo)） 等相關(guān)通路，并且高表達(dá)TGF-β受體，構(gòu)成了一個完整的、對TGF-β信號敏感的促轉(zhuǎn)移細(xì)胞單元（Figure 6F-H; Table S5）。

接著，細(xì)胞通訊分析發(fā)現(xiàn)了pLN+特異的信號傳遞路徑。 通過CellChat工具對細(xì)胞間相互作用進(jìn)行推斷，我們發(fā)現(xiàn)了一個關(guān)鍵且特異的信號模式：僅在pLN+樣本中，存在一條從CAFs指向C0和C1腫瘤細(xì)胞亞群的強效TGF-β信號流（Figure 6I, J）。這從計算上證明了CAFs與特定腫瘤亞群之間存在功能性的旁分泌對話，而這種對話是pLN+腫瘤所特有的。

最后，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)為上述互作提供了原位的、可視化的鐵證。 為了驗證CAFs與C0/C1亞群是否在物理空間上具備互作條件，我們進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果清晰地顯示，在pLN+腫瘤組織內(nèi)，CAF特征、C0和C1亞群特征在空間上顯著共定位，并且它們的表達(dá)水平呈強正相關(guān)；而在pLN−腫瘤中，這種共定位和相關(guān)性則缺失或為負(fù)相關(guān)（Figure 6K-N）。這無可辯駁地證實，在pLN+腫瘤中，分泌信號的CAFs與接收信號的“TGF-βI陽性”腫瘤細(xì)胞在解剖位置上緊密相鄰，形成了一個驅(qū)動轉(zhuǎn)移的“生態(tài)位”�；�因集變異分析（GSVA）進(jìn)一步顯示，EMT通路在pLN+腫瘤的這些特定區(qū)域被顯著激活（Figure S8G, H），將空間定位、細(xì)胞通訊與最終的功能表型完美銜接。

圖6 單核與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析CAF來源的TGF-β旁分泌信號軸在空間生態(tài)位中對特定腫瘤細(xì)胞亞群EMT表型的驅(qū)動作用

結(jié)論
本研究通過整合蛋白基因組學(xué)、單細(xì)胞與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，系統(tǒng)繪制了口腔鱗癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的多維分子圖譜。我們首次揭示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移并非孤立事件，而是由 “細(xì)胞外基質(zhì)重塑-POSTN-TGF-β信號軸-免疫抑制微環(huán)境” 構(gòu)成的動態(tài)網(wǎng)絡(luò)所驅(qū)動的系統(tǒng)性病理過程。其中，單細(xì)胞與空間分辨技術(shù)清晰展現(xiàn)了 CAFs與特定“TGF-βI陽性”腫瘤細(xì)胞亞群在空間上形成功能單元，并通過 TGF-β旁分泌信號特異性驅(qū)動EMT 的關(guān)鍵細(xì)胞（Figure 5G, 6）。

這項工作將OSCC轉(zhuǎn)移的研究視角，從腫瘤細(xì)胞內(nèi)部的遺傳變異，成功擴展至 “腫瘤細(xì)胞-基質(zhì)細(xì)胞-免疫細(xì)胞”在三維空間中的互作生態(tài)。這不僅深化了對轉(zhuǎn)移機制的理解，更重要的是，它指明了超越傳統(tǒng)靶向治療的新方向：未來針對OSCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的治療策略，或?qū)⒕劢褂谕呓釩AF與腫瘤細(xì)胞的致命聯(lián)盟（如靶向TGF-β信號、POSTN或特定CAF亞群），并同步逆轉(zhuǎn)免疫抑制微環(huán)境。本研究鑒定出的POSTN、TGFBI及“TGF-βI陽性”亞群等，為開發(fā)新型預(yù)后生物標(biāo)志物和聯(lián)合治療策略提供了堅實的理論依據(jù)與潛在靶點。

參考文獻(xiàn)：
Liu Y, Yang Z, Pu JJ, Zhong J, Khoo US, Su YX, Zhang G. Proteogenomic characterisation of primary oral cancer unveils extracellular matrix remodelling and immunosuppressive microenvironment linked to lymph node metastasis. Clin Transl Med. 2025 Mar;15(3):e70261. doi: 10.1002/ctm2.70261. PMID: 40038875; PMCID: PMC11879901.

本產(chǎn)品專為從動物組織中分離高純度的單細(xì)胞核而設(shè)計。組織通過勻漿、裂解細(xì)胞膜等步驟釋放完整細(xì)胞核，同時維持核膜穩(wěn)定性及染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，優(yōu)化的密度梯度離心或離心管柱技術(shù)可進(jìn)一步去除細(xì)胞碎片和雜質(zhì)，從而可滿足下游單細(xì)胞組學(xué)、表觀遺傳學(xué)等前沿研究領(lǐng)域?qū)��?xì)胞核的質(zhì)量要求。本產(chǎn)品突破傳統(tǒng)解離法對樣本活性的依賴，廣泛適用于新鮮或新鮮冰凍組織，并兼容微量組織（<10 mg）；全流程操作簡捷，為復(fù)雜樣本提供標(biāo)準(zhǔn)化的解決方案。