高分辨率熒光標測技術(shù)在心臟興奮活動可視化實驗中的應(yīng)用

動作電位（Action Potential，AP）的分析指標：
1) AP：是指心肌細胞在受到有效刺激后，細胞膜電位發(fā)生的一種快速、短暫且可逆的電位變化。
2) 心率 (Heart Rate, HR)：HR=1000/BCL(ms) × 60，其中BCL為相鄰兩個AP之間的周期（ms）。
3) 激活時間 (Active Time)：由激活起點至全部細胞完成激活的時間差，通�；�于熒光變化速率最大（dF/dt max）時間點進行判定。
4) 傳導(dǎo)速度 (Conduction Velocity, CV)：從最先興奮的像素點到最后興奮的像素點的平均速度，CV=d/t，其中d為最早與最晚激活像素點間的距離，t為對應(yīng)時間差（ms）。
5) 傳導(dǎo)離散度 (Conduction Dispersion)：表示不同區(qū)域傳導(dǎo)速度的空間變異性，通常以標準差或變異系數(shù)形式量化。
6) 上升時間 (Rise Time)：AP上升（Depolarization）期間，從基線至峰值所需時間。
7) AP 時程（APD）：細胞膜從AP去極化起始到復(fù)極化完成、膜電位恢復(fù)至靜息水平的總時間，常用APD90表示復(fù)極至90%所需時間。
8) APD 異質(zhì)性（離散）：AP時程離散度表明 AP復(fù)極時程的均一性。

鈣瞬變（Calcium Transient，CaT）信號的分析指標：
1) CaT振幅 (Amplitude)：CaT波形峰值相對于基線的高度，代表胞內(nèi)游離Ca2+的最大濃度。
2) 鈣釋放時間 (Time to Ca2+ Release, Ton)：從Ca2+開始釋放至達到最大濃度的90%所用時間。
3) CaT時程 (CTD)：CaT從峰值下降至基線的時間，如CTD₉₀指鈣濃度恢復(fù)至90%的時間。
4) CTD異質(zhì)性（離散）：鈣瞬變時程離散度表明鈣瞬變時程的不均一性。

其他關(guān)鍵指標：
1) 電交替(Electrical Alternans)：同一起搏點下，心電信號出現(xiàn)規(guī)律性交替；定義閾值：APD差值 >5ms 或Ca2+瞬變交替的振幅變化率＞20%。
2) 鈣衰減時間常數(shù)（Calcium decay time constant，Tau）：胞內(nèi)鈣濃度從峰值水平衰減到峰值的1/e（約37%）所需的時間。
3) 舒張期間期(Diastolic Interval, DI)：從AP復(fù)極結(jié)束至下一次激活開始所用的時間。
4) 心室有效不應(yīng)期（Ventricular Effective Refractory Period，VERP）：心室肌細胞從一次動作電位的去極化起始（0期去極化）到復(fù)極化進程中膜電位恢復(fù)至約-60mV的時間段內(nèi)，無論施加強度多大的刺激，均無法觸發(fā)一次新的可傳導(dǎo)動作電位的時期。
5) 竇房結(jié)恢復(fù)時間（Sinus Node Recovery Time，SNRT）：竇房結(jié)恢復(fù)時間（SNRT）是通過心房超速起搏抑制竇房結(jié)自律性后，停止起搏，從最后一個心房起搏脈沖到第一個自主竇性P波起點的時間間隔，是評估竇房結(jié)自律功能的核心電生理指標。

染料介紹：
1) Rhod-2AM(Rhod-2 acctoxymcthylcster)是一種細胞膜透過性鈣離子敏感熒光染料，分子質(zhì)量為 1123.94g/mol 標準配制溶劑為 DMSO，配制和保存過程需要全程避光。
2)RH-237(4-[2-[6-(Dioctylamino)-2-naphthyl]ethenyl]-1-(3-sulfopropyl)pyridinium hydroxideinner salt)是一種膜電位敏感熒光染料，常與鈣敏感染料(如Rhod-2AM)聯(lián)用。其分子質(zhì)量為 496.7g/mol，推薦溶劑為DMSO，避光條件下輕柔渦旋混勻，必要時進行短時間超聲助溶。

Protocol（小鼠光標測實驗案例）

一、實驗前準備
（一）主要試劑：
KH液、RH-237、Rhod-2AM、Pluronic F-127、Blebbistatin、肝素鈉溶液。

（二）主要器材：
手術(shù)剪1把 、眼科剪1把、眼科彎鑷2把、止血鉗1把、手術(shù)縫線（5-0）、100mL量筒1個、2 mL注射器1個、20mL注射器1個、主動脈插管1個、主動脈夾、10cm玻璃培養(yǎng)皿1個、3.5cm培養(yǎng)皿1個、顯微鏡。

（三）主要溶液配方：
1.KH液

注：KCl、KH2PO4、MgCl2 6H2O可配制為10×母液；溶液配好后需經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾；
KH液配制完成后，在使用前，提前30min充氧（混合氧：95%O2, 5%CO2）飽和。

2.肝素鈉溶液：生理鹽水配制，1000U/mL。
3.興奮-收縮解偶聯(lián)劑Blebbistatin母液，DMSO溶解1mg/ml，分裝為100µL/tube， -20℃儲存?zhèn)溆�。（摩爾質(zhì)量292g/mol）
4.制備熒光染料的母液：為避免反復(fù)凍融，將染料提前配制并進行分裝儲存于-20℃。
A: 電壓敏感染料RH237，DMSO溶解為1mg/mL，分裝為40µL/tube；
B：鈣指示劑Rhod-2AM，DMSO溶解為1 mg/mL，分裝為40µL/tube。

二、模型的制備
（一）心臟獲取與處理
1.C57小鼠稱重，腹腔注射肝素鈉（100U/20g），15min后脫頸處死。
2.然后置于實驗臺固定，倒“T”形開胸，暴露心臟。用鑷子夾起肺，使心臟提起，沿肺后部快速剪下心臟, 取心臟置于裝有預(yù)冷KH液的玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)。

（二）Langendorff灌流
1.在體式鏡下迅速找到主動脈，剪去多余組織，將主動脈小心套在套管底部，用手術(shù)縫線（規(guī)格6-0）結(jié)扎扎緊，并將注射器內(nèi)預(yù)先準備的KH液輕輕推入心臟，泵出心臟殘血，進行Langendorff灌流。灌流速度為2.5mL / min，灌流溫度為37±0.5℃。灌流15min，排出心臟內(nèi)殘余血液及使心臟恢復(fù)正常節(jié)律。

三、高分辨熒光標測記錄（全過程均在避光環(huán)境下進行）
（一）停跳及熒光染色
1.心臟穩(wěn)定后，在50mL循環(huán)KH液中加Blebbistatin（150μL），使心臟停跳；
2.加入Pluronic F-127（20μL）脫酯化，輔助鈣負載，循環(huán)灌流15min；
3.將鈣指示劑20μL Rhod-2AM稀釋從給藥口緩慢注射+20μL Rhod-2AM直接加入循環(huán)罐；
4.將電壓敏感染料RH237（40μL）加入循環(huán)罐后，循環(huán)灌注35min；
5.將負載完染料的心臟移至成像灌流室。

（二）數(shù)據(jù)采集
1.將心電圖（ECG）電極放置心臟兩側(cè)，連續(xù)記錄ECG。
2.激發(fā)光由兩個530±25 nm的LED光源發(fā)出，并在511–551nm處進行了帶通濾波（LEDC-2001，MappingLab）。
3.通過物鏡收集來自心臟的發(fā)射光，并用二向分色鏡在630nm處分離信號。其中AP信號在700nm處進行長通濾波，而細胞內(nèi)Ca2+信號用590nm帶通濾光片（帶寬35nm）進行濾波。使用兩個CMOS攝像頭（OMS-PCIE-2002，MappingLab）0.8kHz的采樣率采集心臟發(fā)出的熒光信號。

四、結(jié)果展示
（一）小鼠實驗結(jié)果展示
1.給予左房8Hz刺激后，記錄左右心房的動作電位與鈣瞬變信號，數(shù)據(jù)展示如下：

A 圖為心臟標測區(qū)域示意圖
B 圖為心房傳導(dǎo)等時圖
C 圖為心房動作電位時程分布圖
D 圖為左右心房動作電位波形代表圖

A 圖心房鈣信號傳導(dǎo)等時圖、鈣瞬變時程分布圖
B 圖為左心房鈣信號波形代表圖

2.竇性節(jié)律下心室數(shù)據(jù)展示：

A 圖為小鼠心室標測區(qū)域
B 圖為心室傳導(dǎo)時間等時圖
C 圖為左右心室動作電位波形圖

3.房顫模型數(shù)據(jù)展示：

A 整個心房致心律失常動作電位交替
B 50Hz起搏刺激下CaT交替的代表圖
C-D 50Hz房顫誘發(fā)過程中折返現(xiàn)象

五、注意事項
1、用去離子水沖洗系統(tǒng)（冷-熱-冷），使系統(tǒng)保持潔凈，并通過調(diào)節(jié)蠕動泵，使出液口達到相應(yīng)的灌流速度；
2、KH液使用前需要提前充氧（ 95%O2 +5%CO2 ）飽和，使灌流液達到氧飽和狀態(tài)；
3、排出灌流系統(tǒng)內(nèi)空氣，使灌流液充滿整個管路；
4、打開循環(huán)水加熱系統(tǒng)，調(diào)節(jié)循環(huán)水溫度，使流出的灌流液溫度為 37℃左右；
5、在光標測實驗過程中，通過灌流系統(tǒng)注射停跳劑和熒光染料時注意避光；
6、通過灌流系統(tǒng)注射停跳劑和熒光染料時，需緩慢勻速注射，防止堵塞冠脈造成心肌梗死。

參考文獻：
[1]Huaxin S ,Jie S ,Kai L , et al.Increased β1-Adrenergic Receptor Antibody Confers a Vulnerable Substrate for Atrial Fibrillation via Mediating Ca2+ Mishandling and Atrial Fibrosis.[J].Clinical science (London, England : 1979),2023,137(2):DOI:10.1042/CS20220654