抗體芯片在癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制研究中的應(yīng)用

一、研究背景
癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移始于其從原發(fā)灶脫落，進(jìn)而突破內(nèi)皮屏障進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，最終于遠(yuǎn)端器官形成轉(zhuǎn)移灶。接觸抑制缺失是侵襲性腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志性特征。有趣的是，常用腫瘤細(xì)胞系的血管侵襲能力受其培養(yǎng)密度調(diào)控：低密度生長(zhǎng)的細(xì)胞展現(xiàn)出比高密度細(xì)胞更強(qiáng)的穿越內(nèi)皮單層的能力。此表型在斑馬魚(yú)卵黃囊模型中得到驗(yàn)證，并且具備可逆性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，侵襲性腫瘤細(xì)胞亞群中靶向大腫瘤抑制激酶1（LATS1）的shRNA顯著富集。LATS1是Hippo信號(hào)通路的關(guān)鍵組分，其功能是抑制下游效應(yīng)因子YAP的活性。

   
二、YAP信號(hào)通路在密度依賴性腫瘤血管侵襲中的作用研究思路
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣本制備
為探究細(xì)胞生長(zhǎng)密度對(duì)血管侵襲性的調(diào)控機(jī)制，本研究以高轉(zhuǎn)移性人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231為模型。實(shí)驗(yàn)設(shè)置如下：將細(xì)胞進(jìn)行低密度培養(yǎng)，以模擬高侵襲性細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。在此基礎(chǔ)上，設(shè)立兩組處理：對(duì)照組（Vehicle處理）與實(shí)驗(yàn)組（使用特異性YAP抑制劑Verteporfin（VP）進(jìn)行處理）。處理完成后，分別收集兩組細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，用于后續(xù)細(xì)胞因子分泌譜的檢測(cè)與分析。

預(yù)期結(jié)果與驗(yàn)證
2.1 證實(shí)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)密度對(duì)其血管侵襲能力具有調(diào)控作用
通過(guò)體外Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)斑馬魚(yú)胚胎轉(zhuǎn)移模型，預(yù)期結(jié)果將驗(yàn)證前述發(fā)現(xiàn)：低密度培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞相較于高密度培養(yǎng)的細(xì)胞，表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的內(nèi)皮屏障侵襲能力。該部分旨在確立本研究表型觀察的基礎(chǔ)。

三、LATS1-YAP信號(hào)軸在密度依賴性血管侵襲中的功能驗(yàn)證
2.2 LATS1-YAP信號(hào)通路是調(diào)控腫瘤細(xì)胞血管侵襲的關(guān)鍵樞紐
為深入解析細(xì)胞密度調(diào)控血管侵襲性的分子機(jī)制，本研究首先通過(guò)功能性篩選，鑒定出在高侵襲性腫瘤細(xì)胞亞群中，靶向大腫瘤抑制激酶1（LATS1）的短發(fā)夾RNA（shRNA）顯著富集。LATS1是Hippo信號(hào)通路的核心組分，其主要功能在于磷酸化并抑制下游轉(zhuǎn)錄共激活因子YAP的活性。

為明確LATS1在密度依賴性侵襲表型中的具體作用，對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行了LATS1基因敲除。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在LATS1缺失條件下，原本侵襲能力較弱的高密度培養(yǎng)細(xì)胞，其侵襲性顯著增強(qiáng)，達(dá)到與低密度細(xì)胞相當(dāng)?shù)乃�平；而低密度�?xì)胞的侵襲能力未受進(jìn)一步影響。此結(jié)果表明，LATS1的缺失足以解除高密度生長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞侵襲的抑制，是介導(dǎo)密度表型差異的關(guān)鍵因子。

在此基礎(chǔ)上，為確認(rèn)其下游效應(yīng)分子YAP的功能，在體內(nèi)及體外模型中應(yīng)用了YAP特異性抑制劑。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制YAP活性后，低密度腫瘤細(xì)胞原本增強(qiáng)的血管侵襲能力被顯著削弱。以上遺傳學(xué)與藥理學(xué)證據(jù)共同證實(shí)，Hippo通路中的LATS1-YAP信號(hào)軸是調(diào)控腫瘤細(xì)胞密度依賴性血管侵襲行為的核心分子通路。

四、基于蛋白質(zhì)芯片篩選YAP下游介導(dǎo)血管侵襲的關(guān)鍵細(xì)胞因子
2.3 鑒定YAP調(diào)控的分泌因子及其在血管侵襲中的功能
為系統(tǒng)探究YAP活性如何影響腫瘤細(xì)胞的分泌譜，進(jìn)而調(diào)控血管侵襲行為，本研究采用抗體芯片技術(shù)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行無(wú)偏倚篩選。分別收集低密度培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)Vehicle（對(duì)照組）或YAP抑制劑Verteporfin（VP，實(shí)驗(yàn)組）處理后的上清液進(jìn)行檢測(cè)。

芯片分析結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，VP處理組細(xì)胞上清中多種細(xì)胞因子的分泌水平顯著下調(diào)，其中包括IL-1α、IL-1β、IL-8以及CXCL1、CXCL2、CXCL3等。

在功能層面，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，低密度腫瘤細(xì)胞的條件培養(yǎng)基能夠顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞單層的劃痕修復(fù)能力，而高密度細(xì)胞的條件培養(yǎng)基則無(wú)此效應(yīng)。此外，使用特異性中和抗體封閉CXCR2（上述部分CXCL因子的共同受體），可有效抑制低密度腫瘤細(xì)胞的血管侵襲能力。

上述結(jié)果共同表明，低密度腫瘤細(xì)胞通過(guò)YAP依賴的方式上調(diào)特定細(xì)胞因子組的分泌，這些因子以自分泌及旁分泌模式作用于腫瘤細(xì)胞自身及周圍微環(huán)境（如內(nèi)皮細(xì)胞），協(xié)同促進(jìn)血管侵襲過(guò)程。

五、LATS1-YAP信號(hào)通路介導(dǎo)密度依賴性血管侵襲的機(jī)制整合
綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究闡明了一條清晰的調(diào)控通路：腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)密度的變化，通過(guò)調(diào)節(jié)Hippo信號(hào)通路核心激酶LATS1的活性，影響其下游效應(yīng)因子YAP的轉(zhuǎn)錄共激活功能。YAP活性的改變進(jìn)一步調(diào)控了包括IL-8、CXCL1/2/3等在內(nèi)的特定細(xì)胞因子組的表達(dá)與分泌。這些因子通過(guò)自分泌作用于腫瘤細(xì)胞自身，并通過(guò)旁分泌作用于微環(huán)境中的內(nèi)皮細(xì)胞，共同構(gòu)成一個(gè)促侵襲微環(huán)境，最終決定性地影響了腫瘤細(xì)胞的血管侵襲能力。該機(jī)制整合示意圖如下所示。

六、抗體芯片檢測(cè)服務(wù)哪里有？
LabEx為您提供全面、高通量的抗體芯片檢測(cè)服務(wù)。我們運(yùn)用先進(jìn)的抗體芯片技術(shù)，能夠在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)定量檢測(cè)上百種蛋白質(zhì)，如細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、磷酸化信號(hào)蛋白等。