文獻分享：多肽修飾的腦靶向LNP 用于腦膠質瘤的治療
mRNA技術在新冠疫苗中的成功應用，推動了其在癌癥免疫治療、遺傳病修復等領域的廣泛研究。然而，由于血腦屏障（BBB）的存在，mRNA藥物難以有效遞送至腦組織，限制了其在中樞神經系統(tǒng)疾病治療中的應用。傳統(tǒng)的遞送方式如顱內注射存在創(chuàng)傷大、難以廣泛覆蓋腦區(qū)的問題，而系統(tǒng)性給藥的脂質納米顆粒（LNP）則多靶向肝臟，無法有效穿透BBB。
因此，開發(fā)一種安全高效、可規(guī)�；a的腦靶向mRNA遞送系統(tǒng)成為當前科研攻關的焦點。近日，董一洲院士團隊在Science Advances上發(fā)表題為“Lipid nanoparticles for mRNA delivery in brain via systemic administration”的研究，報道了一種新型腦靶向LNP用于腦膠質瘤的治療。
文中LNP使用了邁安納(上海)儀器科技有限公司的納米藥物制備系統(tǒng)進行制備。
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01 實驗結果
新型可離子化脂質的篩選與優(yōu)化
SLNPs的合成與表征：本研究成功設計并合成了一系列基于SR-57227的離子化脂質（SLs），其結構包含SR-57227頭部、氨基連接鍵和可生物降解的脂質尾部（圖1A）。通過核磁共振氫譜和質譜驗證了合成的SLs的結構準確性。進一步，將SLs與膽固醇（Chol）、二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG2k）和熒光素酶（FLuc）mRNA混合，制備成SLNPs。動態(tài)光散射儀測定結果顯示，SLNPs的粒徑范圍在120至180納米之間，PDI均低于0.3，表明SLNPs具有良好的分散性。
體外mRNA遞送效率評估：通過體外細胞實驗，評估了不同SLNPs在N2a神經母細胞瘤細胞系、原代星形膠質細胞和bEnd.3腦內皮細胞系中的mRNA遞送效率。實驗結果顯示，S0、S4和S6 LNPs在所有測試的細胞類型中均展現(xiàn)出最高的熒光素酶活性（圖1B）。基于這些結果，選擇S4 LNP進行進一步的體內驗證。
Fig. 1. Construction of SLNPs for brain delivery.
體內mRNA遞送效率優(yōu)化：通過正交實驗優(yōu)化了S4 LNP的脂質成分比例，篩選出最優(yōu)配方OS4 LNP（圖2A-C）。
體內實驗結果顯示，靜脈注射FLuc OS4 LNP后，腦組織中的熒光素酶活性顯著高于MC3、SM-102和ALC-0315 LNPs，分別提高了約13.3倍、12.5倍、9.6倍和2倍（圖2D, E）。這些結果表明，OS4 LNP在穿透BBB和遞送mRNA至腦組織方面具有顯著優(yōu)勢。
Fig. 2. Optimization and evaluation of S4 LNP for brain delivery.
細胞穿透肽修飾增強腦遞送效率
CPPs修飾對LNP性質的影響：為了進一步提高OS4 LNP的腦遞送效率，本研究通過點擊化學將10種不同的細胞穿透肽（CPPs）修飾到OS4 LNP表面。實驗結果顯示，A5K、THR和LAH4肽修飾導致OS4 LNP發(fā)生聚集，粒徑超過450納米（圖3B），因此排除了這些肽的進一步研究。
在剩余的7種CPPs中，pVEC、RVG和Tat肽修飾顯著提高了OS4 LNP的腦遞送效率，其中Tat肽修飾的OS4T LNP展現(xiàn)出最高的遞送效率，比未修飾的OS4 LNP提高了約12.7倍（圖3C）。
BBB穿透機制研究：通過Transwell遷移實驗，研究了OS4和OS4T LNP穿透BBB的機制。實驗結果顯示，OS4 LNP的穿透作用主要通過巨胞飲作用和穴樣內陷途徑介導，而OS4T LNP則利用多種途徑穿透BBB。
Fig. 3. The mRNA delivery efficiency and safety of CPP-conjugated OS4 LNPs.
不同腦細胞類型中的mRNA遞送效率
GFP mRNA遞送效率：通過靜脈注射GFP mRNA負載的OS4T LNP至C57BL/6J小鼠體內，12小時后通過流式細胞術分析不同腦細胞類型中的GFP表達。實驗結果顯示，與MC3 LNP相比，OS4 LNP顯著提高了神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞和腦毛細血管內皮細胞（BCECs）中的GFP表達（圖4A）。Tat修飾進一步增強了OS4T LNP在這些細胞類型中的遞送效率（圖4A）。
Cre mRNA遞送效率：在Ai14小鼠模型中，通過靜脈注射Cre mRNA負載的OS4T LNP，7天后通過流式細胞術和免疫熒光成像分析tdTomato表達。實驗結果顯示，單次注射OS4T LNP后，神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞和BCECs中的tdTomato陽性細胞比例顯著高于MC3 LNP組（圖4B）。此外，三次注射OS4T LNP進一步提高了這些細胞類型中的基因編輯效率（圖4B）。免疫熒光成像結果也證實了OS4T LNP在腦組織中的廣泛遞送（圖4D-G）。
Fig. 4. OST4 LNP enables effective mRNA delivery into different brain cells.
膠質母細胞瘤治療
eIL-12 mRNA的設計與驗證：為了降低IL-12的系統(tǒng)性毒性，本研究設計了一種工程化IL-12（eIL-12）mRNA，其通過MMP9敏感的連接子與IL-12受體β1鏈融合（圖5A）。體外實驗結果顯示，eIL-12能夠在MMP9存在的情況下被切割，釋放出具有生物活性的IL-12（圖5B）。此外，與野生型IL-12 mRNA相比，eIL-12 mRNA在健康C3H/HeJ小鼠中表現(xiàn)出更好的耐受性（圖5C）。
抗腫瘤治療效果：在正位膠質母細胞瘤小鼠模型中，通過靜脈注射OS4T LNP包裹的eIL-12 mRNA，評估其對腫瘤生長和生存期的影響。實驗結果顯示，與對照組相比，OS4T-eIL-12 LNP治療顯著抑制了腫瘤生長（圖5E），并延長了小鼠的生存期（圖5F）。治療組小鼠的中位生存期延長至37天，是對照組（17天）的兩倍以上。此外，治療未引起顯著的體重下降和其他副作用，表明OS4T-eIL-12 LNP具有良好的安全性和有效性。
免疫反應分析：通過流式細胞術和細胞因子檢測，分析了OS4T-eIL-12 LNP治療后的免疫反應。實驗結果顯示，治療顯著上調了腦組織中M1型巨噬細胞和 microglia 的標記物（CD80、CD86和iNOS）的表達，并減少了調節(jié)性T細胞的比例。同時，治療還激活了CD8+ T細胞，表現(xiàn)為TNF-α+和CD69+ CD8+ T細胞比例的增加。此外，治療組腦組織中的IFN-γ水平顯著高于對照組，進一步證實了eIL-12的免疫激活作用。
Fig. 5. Therapeutic efficacy of OS4T LNPs in an orthotopic mouse model of GBM.
02 小結
本研究通過設計新型可離子化脂質并結合細胞穿透肽修飾，成功開發(fā)了一種能夠高效穿透BBB的LNP系統(tǒng)（OS4T LNP）。該系統(tǒng)通過全身給藥途徑實現(xiàn)了mRNA在腦組織中的高效遞送，并在膠質母細胞瘤小鼠模型中展現(xiàn)出顯著的治療效果。OS4T LNP的成功開發(fā)為中樞神經系統(tǒng)疾病的治療提供了新的策略，并有望推動mRNA藥物在腦部疾病中的臨床應用。
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參考文獻：Lipid nanoparticles for mRNA delivery in brain via systemic administration.
