ADC藥物（抗體偶聯(lián)藥物）的下游純化策略、技術(shù)難點及對應的解決方案

抗體偶聯(lián)藥物（Antibody–drug conjugates，ADCs）被譽為腫瘤治療的“生物導彈”，通過抗體靶向腫瘤細胞，精準釋放細胞毒性載荷，極大提升了療效并降低系統(tǒng)毒性。自2000年首款ADC藥物Mylotarg上市以來，全球已有超17款ADC藥物獲批（截至2024年），覆蓋血液瘤和實體瘤，市場估值超百億美元。而ADC的復雜結(jié)構(gòu)對生產(chǎn)工藝提出了極高要求，本文將深入剖析ADC下游純化的策略、技術(shù)難點及對應的解決方案。

生物制品工藝開發(fā)的核心目標在于構(gòu)建穩(wěn)健可控的生產(chǎn)工藝體系，確保可重復制備出符合預設(shè)質(zhì)量屬性的產(chǎn)品。

對于傳統(tǒng)非抗體偶聯(lián)藥物（Non-ADC biologics），其關(guān)鍵質(zhì)量屬性（Critical Quality Attribute, CQA）包括可能影響臨床安全性與有效性的關(guān)鍵指標，如產(chǎn)品大小相關(guān)變異體（如聚集體、片段）、電荷異質(zhì)性、氧化變體等，工藝相關(guān)雜質(zhì)（宿主細胞蛋白、DNA殘留）、濃度、活性等。

而ADC由于兼具生物大分子與化學小分子的雙重特性，還需額外關(guān)注其他質(zhì)量屬性，包括藥物抗體比率(Drug-to-Antibody Ratio, DAR)，DAR值的分布、游離毒素殘留、偶聯(lián)反應溶劑殘留等。

• DAR值以及DAR值的分布：其直接影響了藥物的有效性與安全性，生產(chǎn)工藝必須確保DAR值以及分布的批間一致；

• 游離毒素：作為高風險工藝相關(guān)雜質(zhì)，這類未偶聯(lián)小分子因缺乏靶向遞送機制，無法特異性作用于靶點，未能提升療效，可能引發(fā)全身毒性風險；

• 偶聯(lián)反應溶劑殘留：工藝開發(fā)需同步關(guān)注偶聯(lián)反應體系中引入的有機溶劑（如DMF、DMSO）、還原劑（如TCEP）等工藝相關(guān)雜質(zhì)的清除效率，確保終產(chǎn)品符合質(zhì)量屬性放行要求。 

在偶聯(lián)反應之后，通常存在游離毒素和溶劑，因此需要去除相關(guān)雜質(zhì)。UF/DF是緩沖液交換生物制品的常用方法。選擇合適截留孔徑的UF/DF膜，可在保留產(chǎn)品的同時有效去除許多低分子量雜質(zhì)，包括潛在的溶劑、游離毒素等相關(guān)雜質(zhì)。如Fig.1所示，理想情況下UF/DF能夠有效將偶聯(lián)反應后的所有雜質(zhì)去除至可接受水平的情況下。

Fig.1 UF/DF雜質(zhì)清除隨透析體積變化的情況

(A) 殘留溶劑  (B) 游離藥物

對于部分ADC，游離毒素和游離毒素相關(guān)雜質(zhì)可能無法通過UF/DF被清除。Fig.2顯示了在使用30 kDa膜進行UF/DF過程中，兩種分子量均小于2 kDa的游離藥物相關(guān)雜質(zhì)的清除行為。雜質(zhì)A可通過UF/DF膜并在此步驟中被清除超過2 log，而雜質(zhì)B在經(jīng)歷10個透析體積的過程中并未顯著被清除。但這可能部分是由于毒素自我聚集，從而在水環(huán)境中增加其表觀尺寸，或游離毒素與ADC之間的非特異性相互作用。

• 如UF/DF無法將游離毒素及相關(guān)雜質(zhì)清除至可接受水平，則需要采用層析純化步驟；

• 如偶聯(lián)反應產(chǎn)生不可接受水平的產(chǎn)物變體或聚集體，則需對ADC進行層析純化。

Fig.2 UF/DF雜質(zhì)清除隨透析體積變化的情況

 (A) 殘留溶劑  (B) 游離藥物

◉ 陽離子層析去除游離毒素

結(jié)合-洗脫色譜法作為一種常規(guī)分離技術(shù)，可有效實現(xiàn)ADC中游離毒素的去除。該方法基于ADC與游離毒分子間顯著的理化特性差異，通過選擇性吸附實現(xiàn)高效分離。

在陽離子層析工藝中，采用低電導、酸性上樣條件下，ADC（裸抗等電點通常較高）帶正電，被填料牢固結(jié)合。而絕大多數(shù)游離毒素分子量小、電荷中性或負電，無法結(jié)合，隨穿透峰被直接去除。如Fig.3所示的典型圖譜，通過上樣穿透和平衡緩沖液淋洗，游離毒素含量可從52.2%顯著降至5.0%。

Fig.3 陽離子交換層析純化圖譜

• 難點：部分疏水性強的毒素可能與填料或ADC發(fā)生非特異性吸附，導致清除不全。

• 解決方案：篩選不同配基的陽離子填料；

在淋洗緩沖液中添加低濃度的有機溶劑或表面活性劑。

◉ 陽離子層析去除聚集體

ADC產(chǎn)品工藝的復雜性，決定了其在偶聯(lián)工藝結(jié)束后可能會導致聚集體含量升高至不可接受的水平，因此在偶聯(lián)后引入純化步驟可能是必要的，以確保該工藝能夠滿足所需產(chǎn)品質(zhì)量要求。對此可采用陽離子結(jié)合-洗脫色譜法，可有效實現(xiàn)ADC中聚集體的去除。如Fig.4 所示，該方法基于聚集體與單體的理化特性差異實現(xiàn)高效分離。

Fig.4 陽離子交換層析聚集體去除結(jié)果

◉ 疏水層析實現(xiàn)DAR值控制

由于不同DAR值的ADC具有不同的疏水性，因此，可用疏水層析對其DAR值進行控制。如Fig.5 所示，DAR 0 化合物具有低疏水性，通常無法被捕獲，上樣過程中流穿，DAR 1、DAR 2 的ADC被HIC捕獲，并在梯度過程中被依次洗脫。

Fig.5 疏水層析分離不同DAR值的ADC

ADC由于兼具生物大分子與化學小分子的雙重特性，其純化需在去除傳統(tǒng)雜質(zhì)的基礎(chǔ)上，還需去除游離毒素、偶聯(lián)反應溶劑殘留以及控制DAR值及其分布等。

為實現(xiàn)上述目標，下游工藝需采用多種純化策略：

• UF/DF實現(xiàn)快速緩沖液交換并去除大部分的小分子雜質(zhì)；

• 通過陽離子交換層析（如Diamond CD-S，具有高載量，良好的有機溶劑耐受性）依據(jù)電荷差異，實現(xiàn)游離毒素的清除及聚集體的有效去除；

• 借助疏水作用層析（HIC）依據(jù)不同DAR值A(chǔ)DC分子疏水性的差異，進行精細分離，從而精確控制DAR值及其分布。

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產(chǎn)品名稱	規(guī)格	貨號
Diamond CD-S	25mL	Al05501

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參考文獻

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