微載體細(xì)胞兼容性對(duì)干細(xì)胞 3D 懸浮擴(kuò)增效率的影響

自1970年代，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem/stromal cells，MSC）成功地被科學(xué)家分離和鑒定出來(lái)后，因其來(lái)源廣泛、制備簡(jiǎn)單、免疫性低和卓越的多向分化能力等優(yōu)點(diǎn)，在細(xì)胞治療、組織工程和再生醫(yī)學(xué)中展現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景。
 
2006年，國(guó)際細(xì)胞治療協(xié)會(huì)（ISCT）規(guī)范了間充質(zhì)干細(xì)胞的定義，只有同時(shí)符合以下三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞（最低標(biāo)準(zhǔn)），才能稱(chēng)之為間充質(zhì)干細(xì)胞。
 

• 貼壁生長(zhǎng)。
• 細(xì)胞表面表達(dá)特定的特異性抗原（標(biāo)記物）：CD105、CD73和CD90陽(yáng)性率在95%以上；CD45、CD34、CD14、CD79和HLA-DR陰性低于2%。
• 且具有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化的能力。

 
開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)流程
下圖展示了整個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞療法的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)全過(guò)程，其中產(chǎn)業(yè)化的一個(gè)巨大挑戰(zhàn) — 批次生產(chǎn)能力亟需最大化，以滿足大量的臨床病人高達(dá)109 cells/dose注射用量需求。傳統(tǒng)2D貼壁培養(yǎng)的人工成本高、批次生產(chǎn)數(shù)量有限；中空纖維生物反應(yīng)器培養(yǎng)，無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖狀態(tài)和質(zhì)量情況。而微載體的貼壁懸浮培養(yǎng)很好地解決了二者的問(wèn)題，球形微載體比表面積大，因此細(xì)胞貼壁面積更大，且微載體易于懸浮和放大生產(chǎn)，極大地提升了間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的單批次產(chǎn)能。


下面以一個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞從spinner flask放大至生物反應(yīng)器為例，闡述微載體用于間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)化放大生產(chǎn)的極大應(yīng)用前景。
 
案例分享
細(xì)胞：羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（AM MSC），臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC MSC）
微載體：Cytodex 1
培養(yǎng)容器：Spinner flask；Bioreactor
結(jié)果
1.Spinner flask中細(xì)胞生長(zhǎng)
 
1.1  細(xì)胞粘附和增殖能力
UC MSC和AM MSC在微載體（MC）上的DT（double time），PD（population doublings）用來(lái)評(píng)估細(xì)胞粘附和增殖能力，UC MSC和AM MSC的平均DT在40.9±9.6 h和47.7±4.3 h；UC MSC和AM MSC的平均PD在4.3±0.4和4.2±0.3。DT和PD與細(xì)胞在T flask中表現(xiàn)相接近。

1.2  表面標(biāo)志物分析
流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示UC 和 AM MSC 在MC和T flask中培養(yǎng)的一致性，呈現(xiàn)出經(jīng)典的 MSC表型。細(xì)胞表面染色顯示標(biāo)志物 CD73、CD90 和 CD105陽(yáng)性，造血細(xì)胞標(biāo)志物 CD14、CD19、CD34 和CD45陰性。此外，UC MSC和AM MSC之間，不同donor來(lái)源之間的UC MSC在其他表面標(biāo)志物表達(dá)上略有不同。

2. bioreactor中放大生產(chǎn)
 
2.1  細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝
三個(gè)donor來(lái)源的UC MSC用于微載體的bioreactor放大生產(chǎn)，并將bioreactor工藝與spinner flask中細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝進(jìn)行對(duì)比。UC MSC在bioreactor中在D14時(shí)細(xì)胞密度均在24×104 cells/mL以上。為了維持細(xì)胞生長(zhǎng)所需要養(yǎng)分，每隔一天進(jìn)行一次50%換液操作，但其糖濃度在D7之后趨于0水平，因此再額外進(jìn)行補(bǔ)糖操作，當(dāng)糖濃度低于0.3 g/L時(shí)，將其補(bǔ)至1.2 g/L。

2.2  基因表達(dá)分析
為一步分析MSC的細(xì)胞分化和應(yīng)用性，定量 RT-PCR用于分析371種與歸巢、免疫調(diào)節(jié)或再生能力相關(guān)的基因。不同donor來(lái)源的UC和AM MSC的在基因表達(dá)水平上會(huì)有差異（圖 6.A）。此外，相比于spinner flask，在受到嚴(yán)格監(jiān)控的bioreactor中， UC MSC在基因表達(dá)上顯示高度的一致性。

3. 成本優(yōu)勢(shì)
 
下圖對(duì)比了2D細(xì)胞工廠和微載體工藝在能提供的表面積和細(xì)胞數(shù)量上的差異，從熱力圖種可以看出，當(dāng)需要每批次生產(chǎn)產(chǎn)能達(dá)到1×109 ~3×1010 cell時(shí)，在20 L bioreactor用微載體培養(yǎng)細(xì)胞是性?xún)r(jià)比最高的生產(chǎn)方式。而單批次生產(chǎn)產(chǎn)能在3×1011 cell以上時(shí)，微載體工藝是幾種2D貼壁工藝中唯一的選擇。

下表中對(duì)比了2D平面培養(yǎng)和微載體貼壁培養(yǎng)的上下限的CoG，在20 L培養(yǎng)體系下，CoGUSP/106 cells為3.24 $，在2000 L中更可降低至0.7 $。均比其他培養(yǎng)體系低出不少。

MSC正越來(lái)越多地應(yīng)用于臨床疾病的治療中，并顯示出良好的治療效果。相信隨著MSC研究的不斷深入，它將為解決多種難治之癥提供新的治療策略。而微載體技術(shù)為其量化生產(chǎn)提供有效途徑，此外，受監(jiān)控的生物反應(yīng)器培養(yǎng)環(huán)境可為間充質(zhì)干細(xì)胞的質(zhì)量保駕護(hù)航。

Cytiva（思拓凡）——Cytopore 1 微載體（干粉）
微載體小球主要被設(shè)計(jì)用于懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)。
Cytopore 微載體的大孔結(jié)構(gòu)促進(jìn)細(xì)胞向珠內(nèi)生長(zhǎng)，同時(shí)微孔為其提供了最高的營(yíng)養(yǎng)利用率。這些特性使需要高再循環(huán)率和高營(yíng)養(yǎng)利用率的細(xì)胞得以生長(zhǎng)。
針對(duì) r-CHO 在攪拌罐培養(yǎng)中的生長(zhǎng)進(jìn)行了優(yōu)化，但也適用于需要類(lèi)似表面電荷的細(xì)胞系。
透明，便于在顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞。
適用于細(xì)胞培養(yǎng)的大孔微載體 Cytopore
Cytopore1 大孔微載體專(zhuān)為懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)而設(shè)計(jì)，適用于貼壁重組中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 (r-CHO) 細(xì)胞的生長(zhǎng)和重組蛋白的生產(chǎn)。
微載體培養(yǎng)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)錨定依賴(lài)性細(xì)胞的高產(chǎn)量培養(yǎng)。Cytopore 微載體是大孔結(jié)構(gòu)，可使細(xì)胞可以在 3D 空間進(jìn)行生長(zhǎng)。其可以提供更大的單位體積表面積，進(jìn)一步提高細(xì)胞的培養(yǎng)密度和產(chǎn)品產(chǎn)量。
功能
由于 DEAE 組與纖維素基質(zhì)偶聯(lián)，導(dǎo)致了微載體會(huì)帶正電。
微載體具有非常精確的孔徑分布和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其表面積與顆粒材料的比率超過(guò) 95:1。
網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)方便觀察染色細(xì)胞在微載體內(nèi)的生長(zhǎng)情況。 Cytiva（思拓凡）——Cytodex 1 微載體（干粉）
用于大多數(shù)已確定的錨定依賴(lài)性細(xì)胞系的通用微載體。
整個(gè)微孔基質(zhì)含有正電荷。
透明，便于在顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞。
特別適用于大多數(shù)已確立的細(xì)胞系以及從原代細(xì)胞和正常二倍體細(xì)胞株的培養(yǎng)物中生產(chǎn)病毒或細(xì)胞產(chǎn)物。
錨定依賴(lài)性細(xì)胞的高產(chǎn)培養(yǎng)
微載體培養(yǎng)技術(shù)可實(shí)現(xiàn)錨定依賴(lài)性細(xì)胞的高產(chǎn)量培養(yǎng)。Cytodex 專(zhuān)為培養(yǎng)各種動(dòng)物細(xì)胞而開(kāi)發(fā)，培養(yǎng)體積從幾毫升到超過(guò) 6000 升不等。在一般的懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)中使用 Cytodex 可實(shí)現(xiàn)每毫升數(shù)百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的產(chǎn)量。
適用于大多數(shù)已確立的細(xì)胞系
通過(guò)用分布在基質(zhì)中的帶正電荷的 DEAE* 組取代交聯(lián)的右旋糖酐基質(zhì)而形成，是一種通用微載體。特別適用于大多數(shù)已確立的細(xì)胞系以及從原代細(xì)胞和正常二倍體細(xì)胞株的培養(yǎng)物中生產(chǎn)病毒或細(xì)胞產(chǎn)物。