實(shí)驗(yàn)室小量 His 標(biāo)簽蛋白純化的填料選型參考

His標(biāo)簽由多個(gè)組氨酸殘基構(gòu)成（一般為6到10個(gè)，6個(gè)最為常見）。由于組氨酸上的N原子能夠與某些過渡金屬離子形成配位鍵，所以利用這一特性，可以使用含有金屬離子配基的填料來捕獲和純化His標(biāo)簽重組蛋白。His標(biāo)簽分子量小，對重組蛋白的性質(zhì)影響很小，一般情況下不需要切除；而且成本較低，易于表達(dá)，是目前最常用的蛋白質(zhì)標(biāo)簽。
 
重組肽HIV疫苗在大腸桿菌中的表達(dá)、純化和復(fù)性
肝細(xì)胞生長因子(Hepatocyte growth factor， HGF)是一類多功能生長因子，具有刺激血管增生作用，通過局部肌肉注射攜帶 HGF 基因的質(zhì)粒 DNA 可明顯促進(jìn)肢體急性缺血部位新生血管的形成，在臨床上具有治療缺血性疾病的應(yīng)用前景Zhang等對質(zhì)粒 pUDK-HGF大規(guī)模純化工藝248 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech February 25, 2011 Vol.27 No.2 Journals.im.ac.cn進(jìn)行了大量研究，工藝成熟，能生產(chǎn)藥用級重組質(zhì)粒pUDK-HGF 注射液。其工藝是堿裂解后離心處理獲得澄清堿裂解液，直接用 Q-Sepharose XL 陰離子交換層析捕獲質(zhì)粒 DNA；再用Sephacryl S-1000分離除去RNA；用Source15Q 對質(zhì)粒 DNA 進(jìn)行精 制。隨著新填料plasmidselect的出現(xiàn)，生產(chǎn)超螺旋質(zhì)粒DNA的工藝隨之更新，因此本文建立新的pUDK-HGF 純化工藝，該工藝為堿裂解細(xì)菌后，用綢布濾去細(xì)胞碎片等絮凝物，獲得堿裂解上清液；上清液經(jīng)300 kDa超濾柱進(jìn)行濃縮，獲得的濃縮液經(jīng)Sephacryl S-1000 層析柱除去 RNA，然后通過plasmidselect 層析柱對超螺旋質(zhì)粒DNA進(jìn)行捕獲，獲得高純度的超螺旋質(zhì)粒DNA，再通過瓊脂糖凝膠6BFF對超螺旋質(zhì)粒 DNA 進(jìn)行脫鹽；最終采用異丙醇沉淀質(zhì)粒 DNA，75％乙醇洗滌，配方溶液重溶獲得產(chǎn)品。
 
變性包涵體通過0.45µm濾膜（Millipore，Billerica，USA）以去除聚集體。將濾液加載到5mL HisTrap FF柱（Ni Sepharose 6 Fast Flow，GE healthcare，F(xiàn)airfield，USA）上，該柱用含有50mM咪唑的緩沖液A平衡。HisTrapFF的結(jié)合容量為每毫升包裝200毫克。用平衡緩沖液洗滌未結(jié)合的蛋白質(zhì)。用緩沖液a中的500mM咪唑以15CV/h的流速洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后根據(jù)在線紫外檢測器（ZHD，志明生物，中國南京）測定的洗脫液吸光度收集結(jié)合的蛋白質(zhì)。用30%飽和（NH4）2SO4沉淀含有靶蛋白的級分以除去咪唑。在3500g離心30分鐘后，收集蛋白質(zhì)沉淀并在緩沖液A中再溶解。然后將再溶解的蛋白質(zhì)溶液加載到含有陽離子交換劑（5mL Hitrap CM FF，GE healthcare，F(xiàn)airfield，USA）的色譜柱上，其結(jié)合容量為250mg/mL填料。加載和洗滌后，用含有0.1-1M NaCl線性梯度的緩沖液A以20CV/h的流速洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。 為了進(jìn)一步提高目標(biāo)蛋白的純度，使用具有Ni Sepharose High Performance（GE healthcare，F(xiàn)airfield，USA）的5mL HisTrap柱純化重組蛋白疫苗。HisTrap HP的結(jié)合容量為每毫升包裝200毫克。與HisTrap FF柱上的過程類似，用含有100-500mM咪唑的緩沖液A以15CV/h的流速洗脫與Draft結(jié)合的蛋白質(zhì)。在變性條件下逐步純化重組蛋白
 
Cytiva（思拓凡）  ——Ni Sepharose 6 Fast Flow填料
思拓凡的Ni Sepharose 6 Fast Flow 是一種基于高度交聯(lián)瓊脂糖（6% Agarose）的金屬螯合親和層析（IMAC）填料，粒徑約為90 μm，表面偶聯(lián)亞氨基二乙酸（IDA）配基并穩(wěn)定螯合鎳離子（Ni²⁺）。該填料專為從細(xì)胞裂解液、發(fā)酵液或培養(yǎng)上清中高效純化帶有組氨酸標(biāo)簽（His-tag）的重組蛋白而設(shè)計(jì)，廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、生物制藥工藝開發(fā)及大規(guī)模生產(chǎn)。 填料具有優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度，可在高流速下運(yùn)行，適用于重力流層析、FPLC系統(tǒng)（如AKTA）以及工業(yè)級層析平臺，支持從小試到放大的無縫工藝轉(zhuǎn)移。
產(chǎn)品特點(diǎn)
• 高動態(tài)結(jié)合載量：對典型His-tag蛋白結(jié)合能力可達(dá)40 mg/mL以上，提升純化效率
• 優(yōu)越的流速性能：耐受高流速，縮短純化周期，提高處理通量
• 高回收率與純度：特異性強(qiáng)，可有效去除宿主蛋白、核酸等雜質(zhì)
• 即用便捷：提供散裝填料及多種預(yù)裝柱形式，減少操作步驟
• 可放大性強(qiáng)：從實(shí)驗(yàn)室研究到GMP生產(chǎn)均可適用，支持工藝驗(yàn)證
• 批次穩(wěn)定性好：嚴(yán)格質(zhì)控確保性能一致，適合長期項(xiàng)目使用  核心功能
• 特異性捕獲帶有單個(gè)或多聚組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白
• 實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的快速、高效富集與初步純化 • 支持批量（batch）和柱上（column）兩種純化模式
• 可重復(fù)使用，降低實(shí)驗(yàn)成本
• 兼容常見變性劑（如尿素、胍鹽），適用于包涵體蛋白純化  
應(yīng)用場景
• 大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的His-tag蛋白純化
• 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究前的樣品制備
• 高通量篩選與自動化純化（如96孔板格式）
• 抗體、疫苗、基因治療載體相關(guān)蛋白的工藝開發(fā)
• 生物藥中試與大規(guī)模生產(chǎn)中的捕獲步驟  應(yīng)用范圍
• 科研領(lǐng)域：高校、研究所的分子生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、細(xì)胞工程等實(shí)驗(yàn)室
• 生物制藥：重組蛋白藥物、單克隆抗體、融合蛋白、酶制劑的開發(fā)與生產(chǎn)
• 診斷試劑開發(fā)：功能性抗原/抗體的制備
• 工業(yè)酶與生物催化：工業(yè)用酶的純化與優(yōu)化  Ni Sepharose 6 Fast Flow 作為Cytiva（原GE Healthcare）經(jīng)典親和填料，是組氨酸標(biāo)簽蛋白純化的行業(yè)金標(biāo)準(zhǔn)，為用戶提供可靠、高效、可放大的純化解決方案，助力用戶加速從實(shí)驗(yàn)室到臨床的轉(zhuǎn)化進(jìn)程。 Cytiva（思拓凡） ——Ni Sepharose High Performance 填料
Ni Sepharose High Performance（HP）是一款以高度交聯(lián)的瓊脂糖為基架、鎳離子螯合基團(tuán)作為配基的親和層析填料。與另外兩款填料相比，它具有最小的粒徑（34 μm），所以使用HP填料進(jìn)行純化時(shí)，可以得到更高的分辨率，樣品的純度也會得到顯著提高，適合用于對純度有較高要求的實(shí)驗(yàn)。
Ni Sepharose High Performance 鎳離子 IMAC 填料用于高分辨率純化帶組氨酸標(biāo)簽的蛋白，具有高結(jié)合載量，可實(shí)現(xiàn)最大回收率。
• 高分辨率 – 粒徑小（平均粒徑為 34 µm）。
• 高結(jié)合載量可實(shí)現(xiàn)高蛋白回收率 — 每毫升填料可回收超過 40 mg 帶組氨酸標(biāo)簽的蛋白。 • 相容多種試劑 — 耐受各種還原劑、去污劑、變性劑和其他添加劑。  
用于回收帶組氨酸標(biāo)簽的蛋白的鎳層析填料，具有較高的回收率
Ni Sepharose High Performance (HP) 親和填料由其上偶聯(lián)有螯合基團(tuán)的高度交聯(lián)的瓊脂糖基架組成。該螯合基團(tuán)預(yù)裝有鎳，可選擇性地保留帶有裸露組氨酸基團(tuán)的蛋白。
該 IMAC 填料的結(jié)合載量達(dá)到 40 mg/mL 以上，可實(shí)現(xiàn)高蛋白回收率。與大基架尺寸相比，基架尺寸小的鎳層析填料純化效率更高。
成功用于已發(fā)表研究
這種親和層析填料可用于以下方面：
• 純化帶組氨酸標(biāo)簽的蛋白，用于研究轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子如何寡聚體化
• 在 Q Sepharose FF 填料串聯(lián)程序中分離包涵體中的重組 HIV-1 蛋白酶   
兼容性空柱
Cytiva 提供多種可供客戶按需填充的空柱。Ni Sepharose High Performance 適用于 HiScale、Tricorn 和 XK 空柱。
便捷的預(yù)填充柱
Ni Sepharose High Performance 填料有以下預(yù)裝柱規(guī)格產(chǎn)品可選：
• HisTrap HP 層析柱：HiTrap 規(guī)格（1 mL 或 5 mL），便于與注射器、蠕動泵或?qū)游鱿到y(tǒng)配合使用。
• His SpinTrap：離心柱，用于使用臺式離心機(jī)進(jìn)行小樣本量篩選。
• His MultiTrap HP：96 孔板，用于使用離心機(jī)或真空設(shè)備進(jìn)行高通量篩選和小規(guī)模純化。
• His Mag Sepharose Ni 磁珠：設(shè)計(jì)用于小規(guī)模純化和篩選。   
其他 IMAC 親和層析填料和層析柱
Cytiva 的解決方案包括各種含鎳填料和其他 IMAC 產(chǎn)品。提供多種選擇，包括高純度、高分辨率、可直接上樣細(xì)胞培養(yǎng)上清液和未澄清大腸桿菌裂解物，并可共價(jià)偶聯(lián)您所需的金屬離子。 在學(xué)校實(shí)驗(yàn)室小量 His 標(biāo)簽蛋白純化的應(yīng)用場景里， Cytiva 的 Ni Sepharose 6 Fast Flow 和 Ni Sepharose High Performance 兩款填料憑借鮮明的性能優(yōu)勢，成為實(shí)驗(yàn)室的優(yōu)選方案。Ni Sepharose 6 Fast Flow 兼顧純化效率與操作實(shí)用性，適配多種純化模式和表達(dá)系統(tǒng)，能輕松滿足常規(guī)小量純化的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)需求；而 Ni Sepharose High Performance 則以高分辨率和高回收率為核心亮點(diǎn)，精準(zhǔn)契合對蛋白純度有嚴(yán)苛要求的科研場景。從基礎(chǔ)的蛋白樣品制備，到深入的分子機(jī)制研究，這兩款填料都能為實(shí)驗(yàn)室 His 標(biāo)簽蛋白純化工作筑牢技術(shù)基礎(chǔ)，幫助科研人員高效推進(jìn)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究探索提供有力的技術(shù)支撐。