文章分享：ADAR1的信號(hào)通路及機(jī)制+巨噬細(xì)胞GPSM1促肥胖機(jī)制研究

在疾病與代謝研究中，一條清晰、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯柯肪�是推進(jìn)課題的“導(dǎo)航儀”。按照“多組學(xué)初篩鎖定候選靶點(diǎn) → 構(gòu)建疾病模型并驗(yàn)證表型與功能 → 深入解析信號(hào)通路及作用機(jī)制 → 小分子藥物的發(fā)現(xiàn)與體內(nèi)外驗(yàn)證”這一四步閉環(huán)，可迅速梳理實(shí)驗(yàn)邏輯。下面小優(yōu)就以兩篇高分文獻(xiàn)為例，帶您逐層拆解。

2025年2月，中國(guó)藥科大學(xué)楊鵬、肖易倍、郝海平教授團(tuán)隊(duì)和南京醫(yī)科大學(xué)姜玉章教授團(tuán)隊(duì)合作在《Nature Cancer》期刊發(fā)表文章，證明了高表達(dá)的ADAR1是前列腺癌（PCa）中一個(gè)重要的致癌靶點(diǎn)，并開發(fā)了一種有效的小分子ADAR1抑制劑ZYS-1，具有顯著的抗腫瘤療效和良好的安全性。

PART1 多組學(xué)初篩（靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)）：ADAR1在前列腺癌中是一個(gè)值得關(guān)注的致癌靶點(diǎn)
通過(guò)分析TCGA和GDC數(shù)據(jù)庫(kù)，作者發(fā)現(xiàn)ADAR1在前列腺癌組織中顯著高表達(dá)，且與高風(fēng)險(xiǎn)、高Gleason分級(jí)及不良生存預(yù)后密切相關(guān)。在組織芯片和多種前列腺癌細(xì)胞系中進(jìn)一步驗(yàn)證，ADAR1蛋白水平明顯高于正常組織；RNA-seq顯示腫瘤內(nèi)A-to-I編輯事件顯著增多，提示ADAR1活性增強(qiáng)。免疫浸潤(rùn)分析表明，ADAR1高表達(dá)與CD8⁺T細(xì)胞、M1巨噬細(xì)胞減少及免疫檢查點(diǎn)分子升高呈負(fù)相關(guān)，暗示其營(yíng)造免疫抑制微環(huán)境，進(jìn)一步支持其作為治療靶點(diǎn)的潛力。

部分相關(guān)熱賣產(chǎn)品

貨號(hào)	名稱
81284	ADAR1 (E6X9R) XP® Rabbit mAb

PART2 造模+表型/功能檢測(cè)：ADAR1對(duì)腫瘤細(xì)胞存活至關(guān)重要
作者在DU-145、VCaP和22Rv1三株前列腺癌細(xì)胞中敲低ADAR1后，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力均顯著下降，同時(shí)出現(xiàn)G0/G1期阻滯和凋亡增加；CRISPR-Cas9敲除ADAR1亦證實(shí)這些表型，且裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)幾乎完全失敗，表明ADAR1對(duì)腫瘤體內(nèi)外存活至關(guān)重要。反之，過(guò)表達(dá)野生型ADAR1可恢復(fù)細(xì)胞增殖和A-to-I編輯水平，而催化失活突變體無(wú)此效應(yīng)，證明ADAR1依賴其脫氨酶活性促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

部分相關(guān)熱賣產(chǎn)品

貨號(hào)	名稱
abs50001	Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒

PART3 信號(hào)通路/機(jī)制研究：ADAR1調(diào)節(jié)腫瘤生存和IFN應(yīng)答信號(hào)并以編輯依賴的方式抑制MTDH的翻譯
RNA-seq顯示，敲低ADAR1后，DU-145和22Rv1細(xì)胞中MYC、E2F和G2/M檢查點(diǎn)通路顯著下調(diào)，而p53、細(xì)胞黏附分子及I型干擾素（IFN）信號(hào)通路明顯上調(diào)，提示ADAR1通過(guò)抑制IFN應(yīng)答和維持增殖信號(hào)促進(jìn)腫瘤存活。ADAR1缺失導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)雙鏈RNA感應(yīng)通路激活，IFNβ分泌增加，關(guān)鍵感應(yīng)蛋白R(shí)IG-I、MDA5和MAVS表達(dá)上升，而cGAS-STING通路未被激活，表明ADAR1主要阻斷dsRNA-MAVS介導(dǎo)的I型IFN信號(hào)。

多組學(xué)篩選發(fā)現(xiàn)ADAR1直接結(jié)合并編輯MTDH mRNA的3′UTR；TCGA數(shù)據(jù)和患者組織驗(yàn)證顯示，MTDH表達(dá)與ADAR1呈正相關(guān)，且腫瘤中其編輯水平和蛋白水平均顯著高于正常組織。機(jī)制研究表明，ADAR1缺失不影響MTDH mRNA總量，卻使其蛋白水平驟降；CHIP實(shí)驗(yàn)表明ADAR1通過(guò)增強(qiáng)MTDH 3′UTR的A-to-I編輯提高其翻譯效率，且該過(guò)程依賴ADAR1的脫氨酶活性。在ADAR1敲低細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MTDH可顯著恢復(fù)增殖、遷移和侵襲能力，表明MTDH是ADAR1下游關(guān)鍵功能靶點(diǎn)，介導(dǎo)ADAR1促癌作用。

貨號(hào)	名稱
12297	PKR (D7F7) Rabbit mAb
3398	Phospho-eIF2α (Ser51) (D9G8) XP® Rabbit mAb

PART4 小分子藥物發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證：ZYS-1抑制PCa細(xì)胞生長(zhǎng)并觸發(fā)IFN反應(yīng)
作者采用基于結(jié)構(gòu)的虛擬篩選，經(jīng)過(guò)2輪篩選出8-Br-Ado分子，對(duì)ADAR1酶活抑制約30%，作為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，最終合成出新化合物ZYS-1，其體外抑制ADAR1脫氨酶活性的IC₅₀達(dá)0.946 μM，對(duì)多種前列腺癌細(xì)胞系的抗增殖活性進(jìn)入亞微摩爾級(jí)別，而對(duì)正常細(xì)胞毒性顯著降低。分子對(duì)接與動(dòng)力學(xué)模擬顯示，ZYS-1在ADAR1催化口袋形成額外σ-hole相互作用；Biacore實(shí)驗(yàn)測(cè)得結(jié)合親和力KD=313 nM；DARTS和CETSA實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)ZYS-1可直接、特異性地結(jié)合并穩(wěn)定ADAR1蛋白。

進(jìn)一步驗(yàn)證表明，ZYS-1以劑量依賴方式抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、集落形成、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)G0/G1期阻滯與顯著凋亡。RNA-seq顯示，ZYS-1處理重現(xiàn)ADAR1敲低效應(yīng)：全局A-to-I編輯水平下降，IFNα/γ、TNF-NF-κB、p53和凋亡通路上調(diào)，MYC、G2M和E2F靶標(biāo)下調(diào)。機(jī)制上，ZYS-1激活MDA5/RIG-I/MAVS軸，顯著增加IFNβ分泌；PKR主要介導(dǎo)生長(zhǎng)阻滯，MDA5主導(dǎo)IFN應(yīng)答，且MTDH蛋白因編輯減少和PKR-eIF2α激活而被抑制，共同阻斷腫瘤存活。

貨號(hào)	名稱
BR100530	Series S Sensor Chip CM5
29147020	Series S Sensor chip CM7, 3-pack
BR100050	Amine Coupling Kit

2022年11月，上海交通大學(xué)胡承團(tuán)隊(duì)在Nature Communications發(fā)表題為“GPSM1 impairs metabolic homeostasis by controlling a pro-inflammatory pathway in macrophages”的研究論文，該研究揭示了巨噬細(xì)胞GPSM1（G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)劑1）促進(jìn)代謝炎癥以加速T2D和肥胖發(fā)展的機(jī)制。GPSM1與T2D和體重指數(shù)BMI強(qiáng)相關(guān)，針對(duì)GPSM1靶點(diǎn)，研究團(tuán)隊(duì)利用Biacore篩選和鑒定出一種小分子化合物AN-465/42243987，它通過(guò)抑制GPSM1功能來(lái)抑制促炎表型，可以成為代謝治療的候選藥物。

PART1：多組學(xué)初篩（靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)）：小鼠肥胖中巨噬細(xì)胞GPSM1表達(dá)上調(diào)
GWASs數(shù)據(jù)庫(kù)表明GPSM1是2型糖尿病（T2D）的易感基因。多組學(xué)研究表明在高脂飲食或遺傳肥胖（ob/ob、db/db）小鼠的內(nèi)臟和皮下白色脂肪組織中，GPSM1的mRNA和蛋白水平均顯著高于瘦小鼠；免疫染色和流式進(jìn)一步證實(shí)，這種上調(diào)主要發(fā)生在脂肪組織巨噬細(xì)胞（ATMs）中。

貨號(hào)	名稱
abs139059	Rabbit anti-GPSM1 Polyclonal Antibody
4874	HSP90 Antibody

PART2 造模+表型/功能檢測(cè)：髓系細(xì)胞中GPSM1缺失可減輕代謝性炎癥并增加能量消耗
髓系缺失 GPSM1 直接減少脂肪巨噬細(xì)胞（尤其 M1）浸潤(rùn)和炎癥因子，局部和全身炎癥隨之下降；這種抗炎效應(yīng)發(fā)生在肥胖和胰島素抵抗之前，且只依賴于巨噬細(xì)胞，與中性粒細(xì)胞無(wú)關(guān)。

髓系缺失 GPSM1 不影響進(jìn)食與活動(dòng)，但可提高氧耗、增強(qiáng)棕色脂肪 UCP1 及產(chǎn)熱基因表達(dá)，說(shuō)明其通過(guò)激活 BAT 而增加能量消耗，部分抵抗肥胖。

貨號(hào)	名稱
4060	Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb
9272	Akt Antibody

PART3 信號(hào)通路/機(jī)制研究：巨噬細(xì)胞中GPSM1被LPS激活后，通過(guò)Gαi3/cAMP/PKA/CREB軸抑制TNFAIP3的轉(zhuǎn)錄，從而刺激NF -κB信號(hào)。
缺失 GPSM1 顯著抑制 IKKα/β 磷酸化、IκBα 降解及 P65 磷酸化與核轉(zhuǎn)位，隨之減少成熟 IL-1β(p17)、活性 caspase-1(p20) 的生成，并降低 TNF-α、IL-6、CCL2 分泌。

RNA-seq 篩選發(fā)現(xiàn) TNFAIP3（A20）是唯一在兩組巨噬細(xì)胞中均被 GPSM1 負(fù)向調(diào)控的下游基因。GPSM1 缺失顯著上調(diào) A20 蛋白，從而抑制 NF-κB 信號(hào)與炎癥；而 A20 敲低或構(gòu)建髓系 GPSM1/TNFAIP3 雙敲小鼠可完全逆轉(zhuǎn)上述抗炎效應(yīng)。

貨號(hào)	名稱
2697	Phospho-IKKα/β (Ser176/180) (16A6) Rabbit mAb
8943	IKKβ (D30C6) Rabbit mAb
61294	IKKα (D3W6N) Rabbit mAb
3033	Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb
31202	IL-1β (D6D6T) Rabbit mAb

PART4 小分子藥物發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證：ZYS-1抑制PCa細(xì)胞生長(zhǎng)并觸發(fā)IFN反應(yīng)
作者采用計(jì)算與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的混合策略篩選潛在的GPSM1抑制劑。作者推測(cè)存在潛在的別構(gòu)位點(diǎn)針對(duì)于GPSM1抑制。通過(guò)AlloSitePro方法在AlphaFold預(yù)測(cè)GPSM1結(jié)構(gòu)，作者發(fā)現(xiàn)了1個(gè)潛在別構(gòu)位點(diǎn)。基于該預(yù)測(cè)位點(diǎn)，作者對(duì)SPECS化合物庫(kù)中的270,000種化合物進(jìn)行了高通量虛擬篩選（HTVS）。隨后，根據(jù)GPSM1—化合物結(jié)合模式的優(yōu)先級(jí)排序，最終篩選出93種化合物。

為評(píng)估這些化合物與GPSM1的活性，作者通過(guò)Biacore 8K對(duì)這93種化合物進(jìn)行篩選，最終篩選出10種代表性小分子。

方法如下：
GPSM1重組蛋白使用PH 4.0的醋酸鈉緩沖液進(jìn)行稀釋，終濃度為20ug/ml。通過(guò)Biacore的偶聯(lián)程序和氨基偶聯(lián)試劑將GPSM1重組蛋白偶聯(lián)在CM5芯片上，目標(biāo)偶聯(lián)量設(shè)置為10000 RU。小分子藥物稀釋成終濃度為50 umol/L，依次流經(jīng)芯片表面，緩沖液為PBS-T和5% DMSO。初步檢測(cè)不同小分子藥物和GPSM1的結(jié)合能力。

進(jìn)一步驗(yàn)證表明，化合物7 AN-465/42243987能顯著抑制促炎表型。

Biacore篩選小分子化合物
然后，作者繼續(xù)通過(guò)Biacore驗(yàn)證AN-465/42243987與GPSM1的結(jié)合能力。結(jié)果表明，AN-465/42243987與GPSM1的親和力為3.47×10-4 M，可作為T2D的候選藥物。

方法如下：
GPSM1重組蛋白使用PH 4.0的醋酸鈉緩沖液進(jìn)行稀釋，終濃度為20ug/ml。通過(guò)Biacore的偶聯(lián)程序和氨基偶聯(lián)試劑將GPSM1重組蛋白偶聯(lián)在CM5芯片上，目標(biāo)偶聯(lián)量設(shè)置為10000 RU。緩沖液包含PBS-T和5% DMSO。AN-465/42243987稀釋成濃度梯度（3.125，6.25，12.5,25和50 uM），以30 ul/min的速率進(jìn)樣120s。在解離階段，使用緩沖液以30 ul/min的速率進(jìn)樣120s。使用親和力檢測(cè)的程序進(jìn)行親和力檢測(cè)。

Biacore驗(yàn)證AN-465/42243987與GPSM1的結(jié)合能力
在小分子藥物篩選和檢測(cè)中，難點(diǎn)通常在于小分子的分子量極小，需要儀器具備極高的靈敏度，才能檢測(cè)到好結(jié)果。Biacore基于SPR原理，作為分子互作領(lǐng)域的金標(biāo)準(zhǔn)，其具備的超高靈敏度實(shí)現(xiàn)了不僅可以檢測(cè)大分子，對(duì)小分子檢測(cè)無(wú)分子量下限。Biacore親和力及動(dòng)力學(xué)檢測(cè)范圍極寬，可以檢測(cè)到小分子化合物與靶點(diǎn)的弱親和作用，所以在小分子藥物的篩選和檢測(cè)中發(fā)揮著不可替代的作用。同時(shí)，多平行進(jìn)樣針和內(nèi)置篩選程序也可以滿足高通量篩選的需求。

Biacore試劑耗材相關(guān)貨號(hào)

貨號(hào)	名稱
BR100530	Series S Sensor Chip CM5
29147020	Series S Sensor chip CM7, 3-pack
BR100050	Amine Coupling Kit
BR100349	Acetate 4.0
29104992	Series S Sensor Chip SA-1-pack
28994951	Series S Sensor Chip NTA, 1-pack

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多組學(xué)初篩
貨號(hào)	名稱
LXBWTA00-1	超高通量單細(xì)胞WTA測(cè)序
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LX-DSP	DSP空間多組學(xué)實(shí)驗(yàn)服務(wù)
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貨號(hào)	名稱
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301105	PolyFect Transfection Reagent
SH30406.05	New Zealand Characterized Foetal Bovine Serum
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abs972	胎牛血清(優(yōu)級(jí))
Abs42024900	百日咳毒素
Abs9270	弗氏完全佐劑
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Abs9447	人胰腺癌類器官培養(yǎng)試劑盒
表型/功能檢測(cè)
貨號(hào)	名稱
Abs580002	谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)檢測(cè)試劑盒
Abs580117	ATP Microplate Assay Kit
Abs50001	Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒
Abs50003	CCK-8試劑盒
Abs580085	甘油三酯（TG）檢測(cè)試劑盒
Abs580042	谷胱甘肽還原酶檢測(cè)試劑盒
信號(hào)通路篩選
貨號(hào)	名稱
2915	Wnt Signaling Antibody Sampler Kit
9910	Phospho-MAPK Family Antibody Sampler Kit
9915	Apoptosis Antibody Sampler Kit
9916	Phospho-Akt Pathway Antibody Sampler Kit
10600023	0.45UM PVDF 300MMx4M 1/PK
10600002	NC 0.45UM 300MMx4M 1/PK
Abs920	ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒
abs9299	一抗二抗稀釋液
檢測(cè)驗(yàn)證
貨號(hào)	名稱
8480	β-Catenin (D10A8) XP Rabbit mAb
9561	Phospho- β-Catenin (Ser33/37/Thr41) Antibody
9664	Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb
4060	Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP Rabbit mAb
3033	Phospho-NF-κB p65 (Ser536) (93H1) Rabbit mAb
abs810355	FH535
abs810648	XAV-939
29051021	HISTRAP HP 1 X 1 ML
17531806	NI SEPHAROSE 6 FF 5 ML
17528101	GSTRAP HP 5 X 1 ML
17075601	GLUTATHIONE SEPHAROSE 4B 10 ML
28990944	Superdex 200 Increase 10/300 GL
BR100530	Series S Sensor Chip CM5
abs50034	CHIP試劑盒
abs9649	Co-IP試劑盒
藥物篩選
貨號(hào)	名稱
BR100530	Series S Sensor Chip CM5
29147020	Series S Sensor chip CM7, 3-pack
BR100050	Amine Coupling Kit
BR100349	Acetate 4.0
29104992	Series S Sensor Chip SA-1-pack
28994951	Series S Sensor Chip NTA, 1-pack
蛋白純化
貨號(hào)	名稱
29051021	HISTRAP HP 1 X 1 ML
17531806	NI SEPHAROSE 6 FF 5 ML
17528101	GSTRAP HP 5 X 1 ML
17075601	GLUTATHIONE SEPHAROSE 4B 10 ML
28990944	Superdex 200 Increase 10/300 GL
29148721	Superdex 75 Increase 10/300 GL
29091596	Superose 6 Increase 10/300 GL