高剪切應(yīng)力降低 ERG，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和肺動(dòng)脈高壓

High Shear Stress Reduces ERG Causing Endothelial-Mesenchymal Transition and Pulmonary Arterial Hypertension

Keywords: ERG; aorto-caval shunt mice; endothelial cells; endothelial-mesenchymal transition; pulmonary arterial hypertension; shear stress.

研究顯示，先天性心臟�。–HD）的外周肺動(dòng)脈（PAs）中存在高剪應(yīng)力（HSS；100 dyn/cm2），如室間隔缺損病伴肺動(dòng)脈高壓（PAH）。在動(dòng)物模型中，病理性HSS已被作為誘導(dǎo)PAH的因素進(jìn)行了研究，然而，HSS 觸發(fā)和誘導(dǎo)肺血管變化進(jìn)展的機(jī)制尚不清楚，最終導(dǎo)致肺血管阻力（PVR）和嚴(yán)重 PAH的不可逆上升。相對(duì)于靜態(tài)條件，當(dāng)PA內(nèi)皮細(xì)胞（PAECs）承受生理層流剪切應(yīng)力（LSS；15 dyn/cm2）時(shí)，KLF 2/4 及其與 SWI/SNF染色質(zhì)重塑因子的相互作用增加，這導(dǎo)致 NOS3（一氧化氮合酶3）、BMPR2（骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2）和 SMAD5（SMAD 家族成員5）等保護(hù)性基因的誘導(dǎo)，以及與血管收縮和平滑肌細(xì)胞增殖相關(guān)的基因的抑制，例如 EDN1（內(nèi)皮素1）。

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ERG（ETS轉(zhuǎn)錄因子家族）促進(jìn) KLF2與血栓調(diào)節(jié)蛋白啟動(dòng)子結(jié)合，維持LSS下的抗凝作用。ERG 驅(qū)動(dòng) SMAD1，同時(shí)抑制 SMAD3 活性以防止內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 （EndMT）。ERG的缺失與 NF-κB（核因子-κB）活性和 EndMT 的抑制有關(guān)。在 PAH 患者肺組織 PAs 中也觀察到 ERG 降低，BMPR2 和 ERG 被認(rèn)為是協(xié)同調(diào)節(jié)以維持 PAEC 穩(wěn)態(tài)。PAH 患者存在 BMPR2 的突變和表達(dá)或功能降低并且還與 EndMT 相關(guān)聯(lián)。BMPR2缺失導(dǎo)致 EndMT 的機(jī)制與染色質(zhì)重塑蛋白HMGA1（高遷移率蛋白A1）的增加有關(guān)。

基于此，在美國(guó)斯坦福心血管研究所、Betty Irene Moore 兒童心臟中心及日本名古屋市立大學(xué)醫(yī)學(xué)研究科新生兒兒科等團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究中，將 PAEC 暴露于與動(dòng)脈（直徑<500μm） PAH 相關(guān)的HSS ，然后確定了這種水平的HSS是否介導(dǎo)BMPR2的下降并誘導(dǎo)EndMT，所涉及的機(jī)制是否與KLF2/4的下降或ERG介導(dǎo)的基因調(diào)控有關(guān)，以及恢復(fù)下降的轉(zhuǎn)錄因子是否可以防止培養(yǎng)細(xì)胞中BMPR2的降低和隨后的EndMT。研究成果發(fā)表于 Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 期刊題為“High Shear Stress Reduces ERG Causing Endothelial-Mesenchymal Transition and Pulmonary Arterial Hypertension”。

首先，利用體外系統(tǒng)將 HSS（100 dyn/cm2；24h）與 LSS（15 dyn/cm2；24h）遞送給人 PAECs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與 LSS 相比，僅 24 小時(shí)的 HSS 誘導(dǎo) EndMT 特征，蛋白質(zhì)免疫印跡評(píng)估顯示，轉(zhuǎn)錄因子SNAI1/2 和間充質(zhì)標(biāo)志物 ACTA2 增加，EC 表面標(biāo)志物 PECAM1 和 CDH5 減少（圖1 A）。免疫熒光成像證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)，并通過另一種間充質(zhì)標(biāo)志物和 EndMT 標(biāo)志物 FSP1（成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1）的增加來(lái)擴(kuò)展這些發(fā)現(xiàn)（圖1 B）。然后，試確定 HSS 介導(dǎo)的 EndMT 是否可能與 BMPR2 的減少有關(guān)，并且確實(shí)觀察到 HSS 介導(dǎo)的該受體的 mRNA 和蛋白質(zhì)水平降低（圖1 C、D）。最近的研究表明，KLF2 的 N6-甲基腺苷修飾可能有助于 EndMT。然而，血流誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子KLF2/4沒有被HSS改變（圖1 E、F）。這些數(shù)據(jù)表明，病理性HSS誘導(dǎo)EndMT。

然后，為了確定哪些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)可能會(huì)因 HSS 而失去活性，對(duì) LSS、HSS 和靜態(tài)培養(yǎng)條件下的 PAEC 進(jìn)行了 H3K27ac CUT&RUN。在全基因組范圍內(nèi)，對(duì)H3K27ac活性降低的峰值進(jìn)行基序富集分析，確定了來(lái)自SOX（SRY-box轉(zhuǎn)錄因子）和ETS（E-26）轉(zhuǎn)錄因子家族中的幾個(gè)候選基序，包括ERG，這是一種可以與KLF2和 SWI/SNF相互作用的先鋒因子。進(jìn)一步測(cè)定表明，LSS下KLF4與ERG的相互作用在HSS下顯著減少。這表明，ERG 降低可能有助于 HSS 誘導(dǎo)的 EndMT。確實(shí)，HSS 顯著降低了 ERG mRNA 和蛋白質(zhì)水平。此外，還通過共聚焦成像對(duì)移植時(shí)切除的 PAH 患者和未使用的供體肺作為對(duì)照的患者的人肺組織切片進(jìn)行 ERG 核表達(dá)評(píng)估。與對(duì)照組 PAs 相比，IPAH 或伴有室間隔缺損的相關(guān) PAH-CHD 患者的 PAs 核 ERG 表達(dá)顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明，病理性HSS降低ERG表達(dá)。

圖1     高剪切應(yīng)力（HSS）誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT）。

接下來(lái)，為了確定ERG的減少是否足以誘導(dǎo)EndMT，用ERG siRNA轉(zhuǎn)染PAECs，將細(xì)胞暴露于LSS。蛋白質(zhì)免疫印跡評(píng)估顯示，PECAM1和CDH5蛋白水平降低，ACTA2和SNAI1/2水平升高。mRNA水平反映PECAM1和CDH5的降低以及ACTA2的增加，但SNAI1或SNAI2沒有改變，這表明這些轉(zhuǎn)錄因子的mRNA升高可能是短暫的。共聚焦圖像顯示，PECAM1和CDH5降低，ACTA2增加。在LSS下，ERG siRNA也降低了BMPR2 mRNA和蛋白質(zhì)水平。

上述研究表明，在 LSS 下降低 ERG 足以誘導(dǎo) EndMT，因此隨后確定了在 HSS 下替換 ERG 是否會(huì)阻止 EndMT。轉(zhuǎn)染慢病毒載體的ERG在HSS下增加了ERG，并通過蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)到PECAM1和CDH5的增加以及ACTA2和SNAI1/2的減少驗(yàn)證了阻止EndMT（圖2 A）。通過共聚焦成像也觀察到這些發(fā)現(xiàn)（圖2 B）。HSS下的BMPR2基因和蛋白表達(dá)也通過轉(zhuǎn)染ERG增加（圖2 C、D）。ERG的表達(dá)降低了細(xì)胞的縱橫比，與內(nèi)皮表型的恢復(fù)一致。這說明，在HSS下轉(zhuǎn)導(dǎo) ERG 可防止 EndMT。

圖2    補(bǔ)充 ERG（ETS 家族轉(zhuǎn)錄因子）可防止高剪切應(yīng)力（HSS）下的內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化 （EndMT）。

進(jìn)一步地，研究人員將上述發(fā)現(xiàn)與小鼠動(dòng)靜脈分流術(shù)產(chǎn)生的 HSS 聯(lián)系起來(lái)，并確定與肺血管變化相關(guān)的進(jìn)行性 PAH 是否可能與 EndMT 相關(guān)及是否可能通過將 ERG 靶向肺 ECs 來(lái)抑制。利用帶有肽標(biāo)簽 AAV2-ESGHGYF 的 AAV2 載體，選擇性靶向肺 ECs，在進(jìn)行假手術(shù)或動(dòng)靜脈分流術(shù)前1周注射用Erg或熒光素酶載體包裹的AAV2-ESGHGYF。結(jié)果表明，這種動(dòng)靜脈分流術(shù)在放置長(zhǎng)達(dá) 8 周進(jìn)行評(píng)估時(shí)會(huì)導(dǎo)致小鼠進(jìn)行性 PAH。此外，假手術(shù)小鼠的腹部超聲成像顯示，下腔靜脈呈均勻顏色（紅色或藍(lán)色）信號(hào)，表明層流，而動(dòng)靜脈分流的小鼠在擴(kuò)大的下腔靜脈中顯示馬賽克顏色圖案，表明腹主動(dòng)脈的血流受到干擾。這說明，動(dòng)靜脈分流術(shù)引起的病理性HSS會(huì)誘發(fā)PAH。

磁共振成像確定，與動(dòng)靜脈分流術(shù)一致，與假手術(shù)相比，兩個(gè)心室和下腔靜脈的尺寸均有所增加，Erg載體的構(gòu)建對(duì)這一特征沒有影響。動(dòng)靜脈分流術(shù)后 8 周，下腔靜脈 CO（圖3 A）和Po2（圖3 B）的升高也不受 Erg 載體的影響。所有組的主動(dòng)脈收縮壓相似（圖3 C）。

心導(dǎo)管檢查顯示，假手術(shù)小鼠的RVSP（右心室收縮壓）在AAV-Erg處理前后無(wú)明顯差異。通過RVSP升高判斷，動(dòng)靜脈分流術(shù)小鼠與假手術(shù)小鼠相比，顯示 PAH（37.2±1.0 vs 21.9±0.6 mm Hg）與先前在該模型中8周的發(fā)現(xiàn)一致。AAV-Erg 處理 導(dǎo)致RVSP變化降低50% 至29.2±0.8（圖3 D）。與假手術(shù)AAV-Erg小鼠相比，AAV-Erg動(dòng)靜脈分流組的LVEDP（左心室舒張末壓）升高，但與用AAV-Con載體處理的動(dòng)靜脈分流小鼠相比，LVEDP沒有升高（圖3 E）。此外，與AAV-Con載體相比，用AAV-Erg處理的動(dòng)靜脈分流小鼠的PVR降低（圖3 F）。

圖3    通過補(bǔ)充肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（PAEC） ERG （ETS家族轉(zhuǎn)錄因子）可減輕小鼠主動(dòng)脈腔靜脈（AV）分流誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓（PAH）。

最后，為了確定補(bǔ)充ERG對(duì)驅(qū)動(dòng)EC表型變化的機(jī)械生物學(xué)刺激的影響，模擬每組小鼠PA樹中的WSS（壁剪應(yīng)力）。在比較PA樹的各級(jí)時(shí)，WSS在所有組中隨血管尺寸減小而增加（圖3 G）。在PA分級(jí)的1至5級(jí)，對(duì)應(yīng)直徑<100µm的血管，與AAV-Con載體治療的假手術(shù)組相比，AAV-Con載體治療的動(dòng)靜脈分流術(shù)的WSS顯著增加。與AAV-Con載體相比，用AAV-Erg處理的動(dòng)靜脈分流小鼠中PA 1至3級(jí)的WSS值較低，盡管它們?nèi)匀桓哂诩偈中g(shù)小鼠（圖3 G）。在PA 4至5級(jí)中，用AAV-Erg處理的動(dòng)靜脈分流小鼠的WSS值與對(duì)照組沒有區(qū)別。

與RVSP的增加一致，動(dòng)靜脈分流的小鼠顯示出RV重量與體重的增加，而AAV-Erg治療的小鼠則減少（圖4 A）。與假手術(shù)小鼠相比，動(dòng)靜脈分流小鼠的LV+S/體重比值同樣增加。因此，用AAV-Con處理的動(dòng)靜脈分流動(dòng)物的RV/LV + S重量比（右心室/左心室+室間隔）升高，但在給予AAV-Erg的動(dòng)靜脈分流小鼠中沒有升高（圖4 A）。在用AAV-Con或AAV-Erg處理的假手術(shù)小鼠中，RV或LV + S/體重比或RV / LV + S的重量比沒有差異。

正如RVSP升高所預(yù)期的那樣，通過ACTA2染色判斷，具有動(dòng)靜脈分流的小鼠在肺泡管和壁水平的遠(yuǎn)端PAs肌肉化增加（圖4 B、C），以及通過tdTomato（標(biāo)記EC）和ACTA2染色陽(yáng)性的細(xì)胞來(lái)判斷EndMT的特征。與AAV-Con載體相比，AAV-Erg處理動(dòng)靜脈分流小鼠的遠(yuǎn)端動(dòng)脈的肌肉化和EndMT均減少（圖4 D、E）。用 AAV-Erg 載體處理的小鼠的假手術(shù)肺中，蛋白質(zhì)免疫印跡預(yù)計(jì) ERG 和 CDH5 會(huì)增加。此外，在用AAV-Con載體治療的動(dòng)靜脈分流小鼠中觀察到的ERG、CDH5和BMPR2的減少通過AAV-Erg載體治療消除，其值與用AAV-Con載體治療的假手術(shù)小鼠中觀察到的值相似（圖4 F）。這些數(shù)據(jù)表明，在動(dòng)靜脈分流小鼠中補(bǔ)充PAEC ERG可防止EndMT并減輕PAH。

圖4     小鼠主動(dòng)脈腔靜脈（AV）分流可誘導(dǎo)遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈（PAs）的內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT）和重塑，這是通過肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（PAECs）中Erg （ETS家族轉(zhuǎn)錄因子）的過度表達(dá)來(lái)挽救的。

圖5    圖形概要

HSS 導(dǎo)致 EndMT 的分子和形態(tài)學(xué)特征，包括內(nèi)皮標(biāo)志物的丟失以及 BMPR2 的丟失和平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物的增加。研究將這與ERG的缺失聯(lián)系起來(lái)，方法是在LSS下減少ERG并重現(xiàn)EndMT，或在HSS下補(bǔ)充ERG并逆轉(zhuǎn)EndMT；然后在帶有動(dòng)靜脈分流的小鼠中概括了 EndMT 和進(jìn)行性 PAH，并表明可以通過使用選擇性靶向肺 ECs 的載體補(bǔ)充 ERG 來(lái)減輕這種反應(yīng)�？傊�，這項(xiàng)研究揭示，病理HSS降低肺EC ERG，導(dǎo)致EndMT和PAH。上調(diào) ERG 的藥物可以逆轉(zhuǎn) HSS 介導(dǎo)的 PAH 和由高血流量或狹窄的 PA 引起的閉塞性血管重塑。

參考文獻(xiàn)：Shinohara T, Moonen JR, Chun YH, Lee-Yow YC, Okamura K, Szafron JM, Kaplan J, Cao A, Wang L, Guntur D, Taylor S, Isobe S, Dong M, Yang W, Guo K, Franco BD, Pacharinsak C, Pisani LJ, Saitoh S, Mitani Y, Marsden AL, Engreitz JM, Körbelin J, Rabinovitch M. High Shear Stress Reduces ERG Causing Endothelial-Mesenchymal Transition and Pulmonary Arterial Hypertension. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2025 Feb;45(2):218-237. doi: 10.1161/ATVBAHA.124.321092. Epub 2024 Dec 26. PMID: 39723537; PMCID: PMC11753934.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39723537/

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