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高分辨熒光標(biāo)測技術(shù)助力進(jìn)行乳鼠心室肌細(xì)胞(NRVM)分離與光標(biāo)測

瀏覽次數(shù)：576　發(fā)布日期：2025-9-16　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

實驗概要：
乳鼠心室肌細(xì)胞（NRVM）取自出生 1-3 天大鼠心臟心室，經(jīng)處理后體外可保留核心生物學(xué)特性，是心血管研究常用模型。其優(yōu)勢在于平衡 “功能保真度” 與 “實驗可操作性”：既高度保留在體心肌功能，比永生化細(xì)胞更貼近真實；又可在體外培養(yǎng)成熟、易獲高純度細(xì)胞，且實驗周期短、成本低，適合大規(guī)模初步篩選與機(jī)制驗證，可為心血管研究搭建橋梁，助力精準(zhǔn)解析疾病誘因、加速發(fā)病機(jī)制破解，并為臨床前藥物研發(fā)提供初篩平臺。

在 NRVM 細(xì)胞層標(biāo)測動作電位與鈣瞬變，意義在于完整、實時可視化心肌多細(xì)胞水平以 “電傳導(dǎo) - 鈣活動” 為核心的興奮 - 收縮耦聯(lián)全過程，進(jìn)而精確定位疾病模型或藥物干預(yù)下的功能紊亂機(jī)制（如電信號異常、鈣處理缺陷及兩者耦聯(lián)失調(diào)），為解析心律失常、心衰等心血管疾病模型機(jī)制、開展高通量藥物篩選及提升藥物心臟安全性評價可靠性提供關(guān)鍵手段。

實驗?zāi)康模?/span>
應(yīng)用高分辨熒光標(biāo)測技術(shù)，檢測乳鼠心室肌細(xì)胞層（NRVM）的動作電位時程、動作電位時程離散、傳導(dǎo)速度、傳導(dǎo)離散度、鈣瞬變時程、鈣瞬變時程離散、鈣傳導(dǎo)速度、鈣傳導(dǎo)離散度等電生理指標(biāo)。

實驗動物：
新生大鼠（3 天左右）

實驗方法：
NRVM細(xì)胞分離、高分辨熒光標(biāo)測技術(shù)

實驗原理：
高分辨熒光標(biāo)測技術(shù)原理：在可興奮樣本上負(fù)載熒光染料，通過高速相機(jī)記錄熒光變化來反應(yīng)樣本中電壓或各種離子濃度的變化，可同步記錄動作電位與鈣信號等電生理指標(biāo)的改變。

Protocol
（NRVM細(xì)胞分離與光標(biāo)測實驗案例）

一、實驗前準(zhǔn)備
（一）主要試劑：
PBS、DMEM/F12、FBS、胰蛋白酶-EDTA（0.25 %，含酚紅）、DNA酶、Ⅱ型膠原酶、青霉素-鏈霉素 (PS，10000 U/mL)、Rhod-2 AM、Pluronic F127、FluoVolt、1.8 mM含鈣臺氏液等。

（二）主要器材：

眼科鑷、顯微鑷、眼科剪、顯微剪、100 μm細(xì)胞篩、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、離心管、滴管等。

（三）主要溶液配方：
1. 膠原酶：1.1 mg/mL Ⅱ型膠原酶+10 mg/mL BSA；
2. 完全培養(yǎng)基：DMEM/F12+ 1 % PS+5 % FBS。
3. 1.8 mM含鈣臺氏液

4. FluoVolt 工作液：1 µL FluoVolt™ Dye、10 µL PowerLoad™ Concentrate、100 µL Neuro Background Suppressor，混勻后加至 900 µL 含鈣臺氏液。

二、乳鼠心臟獲取與處理
1. 75 % 酒精消毒后，平放乳鼠，沿腋下剪開胸腔，擠出心臟，用剪刀剪取心室，放入PBS中輕輕擠壓心臟，排出多余殘血；去除心臟殘余的心房和血管等組織，只保留心室，轉(zhuǎn)移至干凈的PBS中剪碎至約1 mm³大小。

2. 收集所有心臟組織，PBS清洗一遍，使用胰酶置換出殘留PBS，4 ℃消化14-16 h。

3. 棄去培養(yǎng)瓶中原有胰酶，使用PBS清洗兩遍以去除殘留胰酶。

三、NRVM細(xì)胞消化與培養(yǎng)
1. 向心臟組織中加入膠原酶清洗，置換出殘留PBS，并加入2 mL膠原酶及DNA酶（DNA酶的量根據(jù)初次消化液總體積確定1：1000加入），于37 ℃ 水浴鍋中輕晃培養(yǎng)瓶消化細(xì)胞，時間為1 min 30 s。

2. 將細(xì)胞懸液加入到提前配置好的完全培養(yǎng)基中以終止消化。
3. 重復(fù)步驟1、2，直到心肌組織殘留較少。
4. 使用100 μm的細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液，200 g離心5 min，2 mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀。

5. 使用細(xì)胞培皿/培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細(xì)胞，并放入到37 ℃ 5 % CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行差速貼壁2 h。

6. 收集上清液，200 g離心5 min，加入1 mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使用計數(shù)儀進(jìn)行計數(shù)。

7. 按照實驗要求進(jìn)行鋪板，每2 天更換一次完全培養(yǎng)基，放入37 ℃ 5 % CO₂培養(yǎng)箱，培養(yǎng)4-6 天后進(jìn)行實驗。

顯微鏡下分離得到的NRVM細(xì)胞

四、NRVM細(xì)胞高分辨熒光標(biāo)測記錄（全過程均在避光環(huán)境下進(jìn)行）
（一）鈣瞬變信號記錄
1. 棄上清，加入鈣指示劑Rhod-2 AM（終濃度為3 μM）和Pluronic F127（0.02 %），放于37 ℃培養(yǎng)箱孵育30 min。
2. 后用含鈣臺氏液（Ca²⁺1.8 mM）清洗一遍去除多余的染料，室溫下靜置30 min充分去酯化。
3. 用520 nm LED燈光激發(fā)NRVM細(xì)胞層熒光信號，通過光路系統(tǒng)中的二相色鏡和不同波長的濾光片分離熒光信號，由高速sCMOS科研相機(jī)采集鈣離子信號。

NRVM細(xì)胞層自發(fā)鈣瞬變信號記錄

NRVM細(xì)胞層在點刺激下鈣瞬變信號記錄-20 mA 1 Hz 2 ms

（二）動作電位信號記錄
1. 棄上清，加入足量 FluoVolt 工作液，室溫避光孵育 25 min。
2. 棄去染色液，用含鈣臺氏液輕晃洗滌 2–3 次后即可檢測。
3. 用520 nm LED燈光激發(fā)NRVM細(xì)胞層熒光信號，通過光路系統(tǒng)中的二相色鏡和不同波長的濾光片分離熒光信號，由高速sCMOS科研相機(jī)采集動作電位信號。