多種成像模式：不犧牲信噪比，同步提升分辨率與光學切片能力
該研究由Alessandro Zunino、Giacomo Garrè、Eleonora Perego、Sabrina Zappone、Mattia Donato、Nadine Vastenhouw 和 Giuseppe Vicidomini 共同完成，研究成果以“Structured detection for simultaneous super-resolution and optical sectioning in laser scanning microscopy”為題，于2025年6月在《Nature Photonics》期刊在線發(fā)表。
重要發(fā)現(xiàn)
01研究背景與原理
激光掃描顯微鏡的三維成像能力關鍵在于光學切片，即分離焦平面以外信號的能力。共聚焦顯微鏡通過物理針孔實現(xiàn)部分切片，但分辨率和信噪比之間存在明顯制約。ISM 技術使用陣列探測器（如SPAD陣列）記錄多幅共聚焦類圖像，再通過計算融合成一幅圖像。傳統(tǒng)ISM重建算法如自適應像素重分配（APR）或多圖像反卷積雖可提高分辨率，卻無法有效抑制離焦光，限制了其在厚樣本中的應用。
s²ISM 方法的核心在于將ISM視為結構照明顯微鏡的一種形式，通過物理模型反演與最大似然估計，顯式分離圖像中的聚焦與離焦成分。該方法基于以下觀察：不同探測器單元所記錄的點擴散函數(shù)（PSF）不僅存在空間形態(tài)差異，其強度分布也隨樣本深度變化，形成所謂的“指紋特征”。s²ISM 利用這一特性，在迭代重建過程中同時估計聚焦平面和離焦平面的圖像，最終丟棄離焦成分，獲得高保真的超分辨率切片圖像。
02實驗設計與驗證研究團隊搭建了自定義ISM系統(tǒng)，配備5×5 SPAD陣列探測器，支持從可見光到近紅外波段的多光子激發(fā)。通過對分辨率靶、熒光細胞切片、斑馬魚胚胎及腦組織等多種樣本成像，系統(tǒng)比較了s²ISM與傳統(tǒng)方法（包括共聚焦、APR、多圖像反卷積及Focus-ISM）在分辨率、光學切片能力和信噪比方面的表現(xiàn)。
結果表明，s²ISM 顯著提高了橫向分辨率，成功分辨出間距低于衍射極限的線對圖案；其光學切片能力較傳統(tǒng)ISM提高了一倍，并可有效去除背景熒光，即使這些熒光與聚焦信號壽命相同。此外，s²ISM 還支持技術上采樣，實現(xiàn)數(shù)字超分辨率，允許在較低采樣率下完成高質量成像，有助于減少光毒性和掃描時間。
03推廣至熒光壽命成像研究進一步將s²ISM擴展至時間域，提出s²FLISM方法，用于熒光壽命成像（FLIM）。該方法不僅分離不同深度的壽命信號，還考慮了探測器各單元的儀器響應函數(shù)（IRF），無需假設熒光衰減模型，顯著提高了壽命估計的準確性和信噪比。在一組實驗中，s²FLISM成功區(qū)分了壽命相近但空間重疊的熒光信號，驗證了其在多目標成像中的應用潛力。
創(chuàng)新與亮點
01突破傳統(tǒng)制約
s²ISM 的主要突破在于徹底解決了ISM技術中“光學切片-信噪比”的權衡問題。傳統(tǒng)方法需人為限制探測器尺寸以換取一定切片能力，導致信號嚴重損失；s²ISM 則充分利用整個探測器陣列接收的光子信息，通過計算實現(xiàn)光學切片，同時保持高探測效率和信噪比。
02技術創(chuàng)新
s²ISM 的核心創(chuàng)新在于提出了一個統(tǒng)一的反演模型，將多探測器圖像視為結構探測的結果，并利用指紋編碼的軸向信息分離信號。該模型兼容多種成像模式（包括單光子、多光子激發(fā)和FLIM），且不依賴硬件改動，可直接應用于現(xiàn)有配備陣列探測器的激光掃描系統(tǒng)。
03應用價值
該方法特別適合活細胞長時間成像、厚組織深層觀測以及多色熒光與壽命混合成像場景。其能力在斑馬魚胚胎（深達40 μm）和小腦切片中的表現(xiàn)尤其突出，顯示出在復雜生物環(huán)境中實現(xiàn)高分辨率、高對比度成像的巨大潛力。
總結與展望
s²ISM 作為一種計算成像方法，成功統(tǒng)一了超分辨率、光學切片和高信噪比這三個傳統(tǒng)上難以兼得的目標。其基于物理模型的反演框架不僅具備嚴謹?shù)睦碚摶A，還具備高度的通用性，可擴展至多光子、熒光壽命、光譜成像等多種模態(tài)。未來，s²ISM 有望整合現(xiàn)代去噪算法與自適應光學系統(tǒng)，進一步提升在強散射、高像差環(huán)境中的成像性能。此外，由于其開源實現(xiàn)和兼容性，s²ISM 或將成為生物醫(yī)學研究中高分辨率體成像的新標準工具，推動從細胞器動態(tài)觀測到組織水平分析的多尺度研究進展。
聲明：本文僅用作學術目的。
Zunino A, Garrè G, Perego E, Zappone S, Donato M, Vastenhouw N, Vicidomini G. Structured detection for simultaneous super-resolution and optical sectioning in laser scanning microscopy. Nat Photonics. 2025;19(8):888-897.
DOI:10.1038/s41566-025-01695-0.
