CD3、CD4、CD8、Treg四款熱門T細(xì)胞磁珠分選實(shí)驗(yàn)流程

T細(xì)胞是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中核心的淋巴細(xì)胞類型，是機(jī)體抵御病原體入侵、維持免疫平衡的核心力量。
 
T細(xì)胞的分類
T細(xì)胞分選是相關(guān)研究中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在磁珠分選實(shí)驗(yàn)中有很多不可忽視的關(guān)鍵點(diǎn)，直接影響著分選實(shí)驗(yàn)的得率和純度。本文將詳細(xì)解析美天旎磁珠分選實(shí)驗(yàn)前后的關(guān)鍵注意事項(xiàng)，并深入解讀四款熱門T細(xì)胞磁珠分選實(shí)驗(yàn)流程（CD3、CD4、CD8、Treg細(xì)胞），涵蓋人源和鼠源樣本，涉及陽性分選，陰性分選及順序分選策略。助您一站式掌握T細(xì)胞磁珠分選核心技術(shù)！

關(guān)于磁珠分選實(shí)驗(yàn)，您務(wù)必要知道的關(guān)鍵點(diǎn)（耐心看完，后附分選實(shí)操案例）

分選前準(zhǔn)備
❖確認(rèn)磁珠
根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)種屬、樣本來源、目的細(xì)胞marker選擇適配的磁珠。
❖確認(rèn)分選策略
根據(jù)您實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)類型以及后續(xù)需求選擇對應(yīng)的分選策略。

陽性分選
目的細(xì)胞被磁性標(biāo)記后，作為陽性標(biāo)記組分直接分選出來。該方法常用于以下情況：
1. 分選表達(dá)單一表面標(biāo)志物的細(xì)胞分選（如CD3+,CD4+,CD8+細(xì)胞）
2. 稀有細(xì)胞的分選 (如循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC、腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞TIL)
3. 表達(dá)較弱的表面標(biāo)志物細(xì)胞分選（如CD133+細(xì)胞）
4. 去除特定細(xì)胞群分選（如TCRαβ+T去除、CD45RA+細(xì)胞去除）

陰性分選/去除分選
非目的細(xì)胞磁性標(biāo)記后從細(xì)胞混合物中去除，即未磁性標(biāo)記的細(xì)胞為目的細(xì)胞。該方法常用于以下情況：
1. 去除特定非目的細(xì)胞群
2. 缺乏目的細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物的分選（如某些腫瘤細(xì)胞、神經(jīng)元）
3. 磁珠分選后需進(jìn)一步通過陽性選擇分選細(xì)胞亞群（CD4+CD25+Treg）
4. 分選后的細(xì)胞表面不可帶有任何磁珠標(biāo)記

順序分選
聯(lián)合使用兩種分選策略，例如先陰選后陽選，或先使用可剪切的REAlease磁珠后進(jìn)行陽性分選。該方法常用于以下情況：
1. 同步分離兩種特定細(xì)胞亞群：首先通過陰性分選去除共同雜質(zhì)細(xì)胞，隨后利用陽性分選將剩余的目標(biāo)細(xì)胞亞群分開
2. 目標(biāo)抗原在非目的細(xì)胞上存在交叉表達(dá)，導(dǎo)致直接陽性分選純度不足
3. 要分選極稀有的細(xì)胞，通過預(yù)富集步驟提高目的細(xì)胞的純度和得率

❖確認(rèn)分選柱
對于不同類型的分選柱選擇，關(guān)鍵是不要超過推薦的細(xì)胞量，否則會使柱子過載，導(dǎo)致分選效果不佳�？筛鶕�(jù)您的細(xì)胞總數(shù)和目標(biāo)細(xì)胞數(shù)、分選策略選擇對應(yīng)的分選柱，可參考下圖。對于具體使用的磁珠，參考每個(gè)磁珠說明書附的數(shù)據(jù)表，進(jìn)行分選柱的選擇。
相關(guān)產(chǎn)品貨號：
❖確認(rèn)分選平臺
根據(jù)您的分選柱，選擇適配的分選平臺。
相關(guān)產(chǎn)品貨號：
❖準(zhǔn)備分選緩沖液
方案1：將MACS BSA Stock Solution（#130‑091‑376）和autoMACS Rinsing Solution（#130‑091‑222）按照1:20配置，作為分選buffer；分選緩沖液需放置4°預(yù)冷。
方案2：如您的細(xì)胞對于疊氮化鈉成分不敏感，可直接選擇autoMACS Running Buffer（#130-091-221）進(jìn)行分選。該buffer內(nèi)含有少量的疊氮化鈉，對某些敏感細(xì)胞，例如神經(jīng)細(xì)胞造成影響。
方案3：含0.5%BSA、2mM EDTA的PBS，配置后調(diào)整PH至7.2，需去除氣泡，氣泡可能導(dǎo)致分選柱堵塞。配好的buffer可先靜置，也可使用真空抽濾、超聲消除氣泡。

❖細(xì)胞計(jì)數(shù)和活性檢測
分選前需要檢測單細(xì)胞樣本的細(xì)胞量及細(xì)胞活率，通過細(xì)胞量計(jì)算您的磁珠添加量；建議起始單細(xì)胞活率達(dá)到85%以上再進(jìn)行磁珠分選，會得到較為理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
您可以選擇對應(yīng)產(chǎn)品提升樣本的初始活性：
細(xì)胞篩網(wǎng)（MACS® SmartStrainers70μm#130-098-462）、
碎片去除試劑（Debris Removal Solution#130-109-398 ）、
死細(xì)胞去除磁珠（ Dead Cell Removal Kit #130-090-101）、
裂紅試劑（Red Blood Cell Lysis Solution (10×)#130-094-183）。

分選過程中
一  磁珠篇
❖美天旎磁珠為膠體溶液，不會沉淀，實(shí)驗(yàn)前不用搖晃即可直接使用。
❖磁珠說明書中推薦的磁珠標(biāo)記的體積適用于1×10⁷的細(xì)胞。當(dāng)您的總細(xì)胞量少于10⁷細(xì)胞，需按照說明使用相同的體積。當(dāng)超過10⁷細(xì)胞數(shù)，將所有試劑體積和總體積按照相應(yīng)比例增加。
❖磁珠孵育溫度為2-8℃，建議在冰箱中避光孵育，直接放置于冰上會使磁珠結(jié)合效率變差。提高溫度或延長孵育時(shí)間均可能導(dǎo)致非特異性磁性標(biāo)記。

二  分選篇
❖分選柱在加樣前需使用緩沖液潤洗，潤洗分選柱的緩沖液請事先回溫至操作環(huán)境溫度，防止預(yù)冷的緩沖液潤洗室溫分選柱，導(dǎo)致分選柱中形成小氣泡，使分選效果不佳。
❖整個(gè)分選過程要盡量快速操作，保持細(xì)胞處于低溫，分選過程中使用的分選緩沖液需預(yù)冷，可防止抗體包裹在細(xì)胞表面以及非特異性的磁性標(biāo)記。
❖每一次向分選柱中加液均需等到分選柱中的液體流空，最后一滴在分選柱中不滴出時(shí)，再進(jìn)行下一步加液。
❖收集分選柱中磁珠標(biāo)記的細(xì)胞液，需要將分選柱從磁場中拿下，放至收集管上，向分選柱加入緩沖液后立即進(jìn)行栓塞按壓；分選柱栓塞只能按壓一次，請勿反復(fù)操作。
❖分選柱為一次性耗材，請勿重復(fù)使用。

分選結(jié)束后
❖利用流式檢測目的細(xì)胞占比及分選后細(xì)胞活性，計(jì)算出分選純度和分選得率，您可參考以下公式進(jìn)行計(jì)算：
·  分選純度=分選后目的細(xì)胞總數(shù)量/分選后所得所有細(xì)胞總數(shù)量
·  分選得率=分選后目的細(xì)胞總數(shù)量/分選前目的細(xì)胞總數(shù)量
注意：分選前目的細(xì)胞總數(shù)量=標(biāo)記后未上柱子前的細(xì)胞懸液*目的細(xì)胞占比
注意：分選前目的細(xì)胞總數(shù)量=標(biāo)記后未上柱子前的細(xì)胞懸液*目的細(xì)胞占比

為您詳細(xì)解讀4個(gè)熱門T細(xì)胞分選實(shí)例，干貨來襲，照搬流程直接做實(shí)驗(yàn)！
Pan T細(xì)胞分選： Pan T Cell Isolation Kit II, mouse
CD4+T細(xì)胞分選：CD4MicroBeads, human
CD8+T細(xì)胞分選：CD8a+ T Cell Isolation Kit II, mouse
Treg細(xì)胞分選：CD4 CD25 Regulatory T Cell Isolation Kit
Pan T細(xì)胞分選：鼠源Pan T細(xì)胞分選試劑盒（#130-095-130）
 
磁性分選耗材
❖LS分選柱（#130-042-401）
❖MidiMACS分選器（#130-042-302）（適用于LS分選柱）
❖MACS MultiStand（#130-042-303）
❖MACS BSA Stock Solution（#130‑091‑376）和autoMACS Rinsing Solution（#130‑091‑222）1:20配置
❖Pre-Separation Filters 30μm預(yù)分離濾器（#130-041-407）（可選，磁珠標(biāo)記前去除細(xì)胞團(tuán)，防止堵塞分選柱）

實(shí)驗(yàn)步驟
一  磁珠標(biāo)記非CD3+細(xì)胞
1.  細(xì)胞計(jì)數(shù)；
2.  細(xì)胞懸液300×g離心10分鐘，棄上清；
3.  細(xì)胞重懸，每1×10⁷細(xì)胞添加40μL分選緩沖液；
4.  每1×10⁷細(xì)胞添加10 μL Biotin-Antibody Cocktail抗體；
5.  混勻，于2-8℃孵育5min；
6.  每1×107細(xì)胞添加30 μL分選緩沖液；
7.  每1×10⁷細(xì)胞添加20 μL Anti-Biotin MicroBeads磁珠；
8.  混勻，于2-8℃孵育10min；
9.添加分選緩沖液，調(diào)整溶液體積至500 μL（注：500 μL體積最大重懸至1×10⁸細(xì)胞，對于更多的細(xì)胞數(shù)量，需要相應(yīng)提高緩沖液體積）

二  磁珠去除非CD3+細(xì)胞
1.  將LS分選柱放入MidiMACS分選器的磁場中。
2.  用3 mL分選緩沖液潤洗分選柱，等到分選柱排空后再進(jìn)行下一步驟；
3.  將制備好的細(xì)胞懸液加入到分選柱中；
4.  收集通過的未被標(biāo)記的細(xì)胞；
5.  用3 mL分選緩沖液沖洗分選柱，收集通過的未標(biāo)記的細(xì)胞，即為富集的T細(xì)胞；
6. （可選）如需非T細(xì)胞，可取出分選柱，將其放至收集管上。吸取5 mL緩沖液到分選柱中，立即將栓塞推入分選柱中，沖洗出磁珠標(biāo)記的非T細(xì)胞。
CD4細(xì)胞分選：人源CD4+T細(xì)胞分選試劑盒（#130-045-101）

磁性分選耗材
❖MS分選柱（#130-042-201）或LS分選柱（#130-042-401）
❖Mini MACS分選器（#130-042-102）或Midi MACS分選器（#130-042-302）
❖MACS MultiStand（#130-042-303）
❖MACS BSA Stock Solution（#130‑091‑376）和autoMACS Rinsing Solution（#130‑091‑222）1:20配置
❖Pre-Separation Filters 30μm預(yù)分離濾器（#130-041-407）（可選，磁珠標(biāo)記前去除細(xì)胞團(tuán)，防止堵塞分選柱）
❖如需進(jìn)行去除分選，需選擇LD分選柱，搭配Midi MACS分選器

實(shí)驗(yàn)步驟
一  磁珠標(biāo)記CD4+細(xì)胞
1. 細(xì)胞計(jì)數(shù)；
2. 細(xì)胞懸液300×g離心10分鐘，棄上清；
3. 細(xì)胞重懸，每1×10⁷細(xì)胞加80 μL分選緩沖液；
4. 每1×10⁷細(xì)胞添加20 μL CD4 MicroBeads, human磁珠；
5. 混勻，于2-8℃孵育15min；
6. 每1×10⁷個(gè)細(xì)胞加入1-2 mL分選緩沖液洗滌細(xì)胞，300×g離心10分鐘，棄上清；
7. 添加分選緩沖液，調(diào)整溶液體積至500 μL（注：500 μL體積最大重懸至1×10⁸細(xì)胞，對于更多的細(xì)胞數(shù)量，需要相應(yīng)的提高緩沖液體積）。
注：如用 LD分選柱去除細(xì)胞時(shí)，每1.25x10⁸個(gè)總細(xì)胞用500μL緩沖液重懸。

二  磁珠分離CD4+細(xì)胞
1. 將分選柱放入對應(yīng)的MACS分選器的磁場中；
2. 用適量緩沖液潤洗分選柱，等到分選柱中液體排空后，再進(jìn)行下一步驟（MS分選柱使用500 μL分選緩沖液潤洗；LS分選柱使用3 mL分選緩沖液潤洗）；
3. 將制備好的細(xì)胞懸液加入分選柱中，收集的流穿細(xì)胞液為未被標(biāo)記的CD4-細(xì)胞；
4. 分別用分選緩沖液清洗柱子三次（MS分選柱使用500 μL分選緩沖液清洗3次；LS分選柱使用3 mL分選緩沖液清洗3次），收集未被標(biāo)記上的CD4-細(xì)胞；
5. 從分選器中取出分選柱，將其放到合適的收集管上；
6. 吸取適量的緩沖液（MS：1 mL；LS：5 mL），加到分選柱中，立即將栓塞推入分選柱中，沖洗出磁珠標(biāo)記的細(xì)胞，即為CD4+T細(xì)胞；
7. （可選）為了提高CD4+細(xì)胞的純度，沖洗出的細(xì)胞可用MS或LS分選柱再次富集。用新的分選柱按照第1-6步重復(fù)磁珠分選步驟即可。

用LD（130-042-901）分選柱去除分選
1. 將LD分選柱放入MidiMACS分選器的磁場中；
2. 用2 mL緩沖液濕潤分選柱；
3. 將制備好的細(xì)胞懸液加到分選柱中；
4. 收集流出來的細(xì)胞，再用1 mL緩沖液沖洗分選柱兩次，收集流出來的液體即為未被磁珠標(biāo)記的CD4-細(xì)胞。
CD8細(xì)胞分選：鼠源CD8a+ T細(xì)胞分選試劑盒（#130-104-075）

磁性分選耗材
❖LS分選柱（#130-042-401）
❖Midi MACS分選器（#130-042-302）（適用于LS分選柱）
❖MACS MultiStand（#130-042-303）
❖MACS BSA Stock Solution（#130‑091‑376）和autoMACS Rinsing Solution（#130‑091‑222）1:20配置
❖Pre-Separation Filters 30μm預(yù)分離濾器（#130-041-407）（可選，磁珠標(biāo)記前去除細(xì)胞團(tuán)，防止堵塞分選柱）
 
實(shí)驗(yàn)步驟
一  磁珠標(biāo)記非CD8+細(xì)胞
1.  細(xì)胞計(jì)數(shù)；
2.  細(xì)胞懸液300×g離心10分鐘，棄上清；
3.  細(xì)胞重懸，每1×10⁷細(xì)胞添加40μL分選緩沖液；
4.  每1×10⁷細(xì)胞添加10 μL Biotin-Antibody Cocktail抗體；
5.  混勻，于2-8℃孵育5min；
6.  每1×10⁷細(xì)胞添加30 μL分選緩沖液；
7.  每1×10⁷細(xì)胞添加20 μL Anti-Biotin MicroBeads；
8.  混勻，于2-8℃孵育10min；
9.添加分離緩沖液，調(diào)整溶液體積至500 μL（注：500 μL體積最大重懸至1×10⁸細(xì)胞，對于更多的細(xì)胞數(shù)量，需要相應(yīng)的提高緩沖液體積）。

二  磁珠去除非CD8+細(xì)胞
1.  將LS分選柱放入Midi MACS分選器的磁場中；
2.  用3 mL分離緩沖液潤洗分選柱，等到分選柱排空后再進(jìn)行下一步驟；
3.  將制備好的細(xì)胞懸液加入到分選柱中，收集通過的未標(biāo)記的細(xì)胞；
4.  用3 mL分離緩沖液沖洗分選柱，收集的流穿細(xì)胞液即為富集的CD8+T細(xì)胞；
5. （可選）如需非CD8細(xì)胞，可取出分選柱，將其放至收集管上，吸取5 mL緩沖液到分選柱中，立即將栓塞推入分選柱中，沖洗出磁珠標(biāo)記的非CD8細(xì)胞。
Treg細(xì)胞分選：人源CD4+CD25+Treg細(xì)胞分選試劑盒（#130-091-301）

磁性分選耗材
❖LD分選柱（#130-042-901）
❖MS分選柱*2（#130-042-201）
❖Mini MACS分選器（#130-042-102）（適用于MS分選柱）
❖Midi MACS分選器（#130-042-302）（適用于LD分選柱）
❖MACS MultiStand（#130-042-303）
❖MACS BSA Stock Solution（#130‑091‑376）和autoMACS Rinsing Solution（#130‑091‑222）1:20配置
❖Pre-Separation Filters 30μm預(yù)分離濾器（#130-041-407）（可選，磁珠標(biāo)記前去除細(xì)胞團(tuán)，防止堵塞分選柱）

實(shí)驗(yàn)步驟
一  磁珠標(biāo)記非CD4+細(xì)胞
1. 細(xì)胞計(jì)數(shù)；
2. 細(xì)胞懸液300×g離心10min，棄上清；
3. 細(xì)胞重懸，每1×10⁷細(xì)胞加90 μL分選緩沖液；
4. 每1×10⁷細(xì)胞添加10μLCD4+ T Cell Biotin-Antibody Cocktail抗體；
5. 混勻，于2-8℃孵育5min；
6. 每1×10⁷個(gè)細(xì)胞加入20μL Anti-Biotin MicroBeads磁珠；
7. 混勻，于2-8℃孵育10min；
8. 添加分離緩沖液，調(diào)整溶液體積至500 μL（注：500 μL體積最大重懸至1×10⁸細(xì)胞，對于更多的細(xì)胞數(shù)量，需要相應(yīng)的提高緩沖液體積）。

二  磁珠去除非CD4+細(xì)胞
Treg細(xì)胞分離第一步是去除非CD4+細(xì)胞，使用LD分選柱
1. 將LD分選柱放入MidiMACS分選器的磁場中；
2. 用2ml分選緩沖液進(jìn)行分選柱潤洗，等到分選柱中液體排空后再進(jìn)行下一步驟；
3. 將制備好的細(xì)胞懸液加入分選柱中，收集通過的未標(biāo)記的細(xì)胞；
4. 分別用1ml分選緩沖液清洗柱子兩次，收集的流穿細(xì)胞液可用于進(jìn)一步分離Treg和Tresp細(xì)胞所需的未標(biāo)記的預(yù)富集的CD4+細(xì)胞組分；
5. 細(xì)胞計(jì)數(shù)。

三  磁珠標(biāo)記CD25+細(xì)胞
1. 細(xì)胞懸液300×g離心10min，棄上清；
2. 細(xì)胞重懸，每1×10⁷細(xì)胞加90 μL分選緩沖液；
3. 每1×10⁷細(xì)胞添加10μL CD25 MicroBeads磁珠；
4. 混勻，于2-8℃孵育15min；
5. 每1×10⁷個(gè)細(xì)胞加入1-2 mL分選緩沖液洗滌細(xì)胞，300×g離心10分鐘，棄上清；
6. 添加分離緩沖液，調(diào)整溶液體積至500 μL（注：500 μL體積最大重懸至1×10⁸細(xì)胞，對于更多的細(xì)胞數(shù)量，需要相應(yīng)的提高緩沖液體積）。

四  磁珠分選CD25+細(xì)胞
Treg分選的第二步是陽性分選CD25+細(xì)胞。該步驟中，依次使用兩個(gè)MS分選柱（1×10⁷標(biāo)記細(xì)胞容量）為了不超過容量限制，建議先通過流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞懸液中CD25+的細(xì)胞濃度。
1. 將MS分選柱放入MiniMACS分選器的磁場中；
2. 用500μL分選緩沖液潤洗分選柱，等到分選柱中液體排空后再進(jìn)行下一步驟；
3. 將制備好的細(xì)胞懸液加入分選柱中，收集通過的未標(biāo)記的細(xì)胞；
4. 分別用500μL分選緩沖液清洗柱子三次，收集的流穿細(xì)胞液即為Tresp細(xì)胞(CD4+CD25-)的細(xì)胞液；
5. 將分選柱從分選器上取出，置于合適的收集管上，添加1ml分選緩沖液到柱子中，立即將栓賽推入柱中，沖洗出磁性標(biāo)記細(xì)胞；
6. 為了提高CD4+CD25+細(xì)胞濃度，洗脫的部分可以在第二個(gè)MS分選柱上富集。使用新的MS分選柱重復(fù)步驟1-6中所述的磁分選步驟。分離得到的Treg和Tresp細(xì)胞可以用于體外抑制分析。

以上就是四款熱門T細(xì)胞磁珠分選的實(shí)驗(yàn)流程！想了解更多T細(xì)胞磁珠產(chǎn)品，小優(yōu)為您總結(jié)了T細(xì)胞分選產(chǎn)品合集：
Pan T細(xì)胞分選：
去除分選：貨號130-096-535 Pan T Cell Isolation Kit , human
陽性分選：貨號130-050-101 CD3 MicroBeads, human
陽性分選：貨號130-136-769 CD3 MicroBeads UltraPure, human
去除分選：貨號130-095-130 Pan T Cell Isolation Kit II, mouse
陽性分選：貨號130-094-973 CD3e MicroBead Kit, mouse
去除分選：貨號130-095-130 Pan T Cell Isolation Kit ,rat
CD4+T細(xì)胞分選：
去除分選：貨號 130-096-533 CD4+ T Cell Isolation Kit, human
陽性分選：貨號 130-045-101 CD4 MicroBeads, human
去除分選：貨號 130-104-454 CD4+T Cell Isolation Kit, mouse
CD8+T細(xì)胞分選：
去除分選：貨號130-096-495 CD8+ T Cell Isolation Kit, human
陽性分選：貨號130-045-201 CD8 MicroBeads, human
去除分選：貨號130-104-075 CD8a+ T Cell Isolation Kit II, mouse
去除分選： 貨號130-093-244 Naïve CD8+ T Cell Isolation Kit, human
Treg細(xì)胞分選：
貨號130-091-301CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, human
貨號130-094-775CD4+CD25+CD127dim/Regulatory T Cell Isolation Kit II, human
貨號130-093-631CD4+CD25+CD45RA+ Regulatory T Cell Isolation Kit, human
貨號130-094-551CD25+CD49d-Regulatory T Cell Isolation Kit, human
貨號130-092-984CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, non-human primate
貨號130-091-041CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit, mouse
Tcr g/d細(xì)胞分選：
去除分選：貨號130-092-892 TCRg/d+ T Cell Isolation Kit, human
陽性分選：貨號130-050-701 Anti-TCRg/d MicroBead Kit, human
去除分選：貨號130-092-125 TCRg/d+ T Cell Isolation Kit, mouse
NKT細(xì)胞分選：
去除分選：貨號130-093-064 CD3+CD56+ NKT Cell Isolation Kit, human
陽性分選：貨號130-094-842 Anti-iNKT MicroBeads, human
美天旎針對腫瘤組織樣本的T細(xì)胞提取有專門的分選產(chǎn)品供您選擇：
T細(xì)胞分選(腫瘤組織)：
貨號130-116-475CD4 (TIL) MicroBeads, mouse-
貨號130-116-478CD8 (TIL) MicroBeads, mouse
貨號130-116-480CD4/CD8 (TIL)MicroBeads, mouse
貨號130-121-562REAlease CD3 (TlL) MicroBead Kit, human
貨號130-121-559   REAlease CD4 (TlL) MicroBead Kit, human
貨號130-121-560   REAlease CD8 (TlL) MicroBead Kit, human