iPSC-CM和成年鼠心肌細胞光學(xué)電生理的高通量動作電位測定

瀏覽次數(shù)：679　發(fā)布日期：2025-9-4　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

高通量心肌細胞功能綜合測評系統(tǒng)系統(tǒng)通過雙通道熒光檢測和高速視像追蹤技術(shù)，捕獲心肌細胞的鈣離子濃度的動態(tài)變化以及膜電位信號，并結(jié)合光學(xué)高速相機同步獲取細胞的實時收縮幅度、收縮速率和頻率等參數(shù)。適用多樣本實驗包括動物成年鼠心肌、乳鼠心肌單細胞與多細胞組織（2D/3D）的檢測如人源誘導(dǎo)多能干細胞（hiPSC）分化的心肌細胞、成人心肌細胞及3D心肌微組織。系統(tǒng)采用封閉式顯微鏡成像主體適配35mm單孔/24孔板設(shè)計，每日（按8小時算）可完成超過1000個細胞樣本實驗，顯著提升實驗效率。結(jié)合機器學(xué)習(xí)算法，自動識別目標(biāo)細胞、跟蹤運動軌跡，并生成標(biāo)準(zhǔn)化報告（如收縮速度、同步性、鈣瞬變峰值時間等），佰諾仕生命科技引進大灣區(qū)首個IonOptix MultiCell HST 高通量心肌細胞收縮功能測量系統(tǒng)并高效完成iPSC-CM和成年鼠心肌細胞的光學(xué)電生理的動作電位測定。

關(guān)鍵詞：

實驗設(shè)置、染料加載/重新加載程序以及減少光毒性:兩種常見細胞模型之間的關(guān)鍵差異

引言：

膜電位動態(tài)是心肌細胞中興奮-收縮耦聯(lián)的基礎(chǔ)。使用電壓敏感熒光染料的光學(xué)技術(shù)常被用于記錄這些電變化。盡管像膜片鉗電生理學(xué)這樣的黃金標(biāo)準(zhǔn)方法提供了精確的測量，但它們需要大量人力且通量有限。相比之下，如FluoVolt這樣的染料可實現(xiàn)對動作電位的快速記錄，使其非常適合于功能測定和高通量篩選應(yīng)用。
不同的心肌細胞模型，如誘導(dǎo)多能干細胞衍生的心肌細胞(iPSC-CMs)和原代成年心肌細胞，展現(xiàn)出不同的生理特性。與成年細胞相比，iPSC-CMs表現(xiàn)出不成熟電生理特性，這可能影響電壓染料加載和信號行為。這些差異主要歸因于它們的發(fā)育狀態(tài)和改變的離子通道表達譜。此外，我們還觀察到iPSC-CMs中染料的攝取效率受到培養(yǎng)密度的影響，高培養(yǎng)密度通常支持更均勻的標(biāo)記。相比之下，初級成年心肌細胞具有更復(fù)雜的膜結(jié)構(gòu)，并且更容易受到化學(xué)或機械處理的影響。這些模型特有的特性需要經(jīng)過優(yōu)化的FluoVolt加載方案，以確保有效的標(biāo)記并準(zhǔn)確捕捉細胞功能。
本應(yīng)用筆記描述了iPSC-CMS與主要成年心肌細胞在實驗設(shè)置、染料加載和重新加載程序以及光毒性方面的關(guān)鍵差異。

上圖表示各種樣本的收縮測量方法

方法：

樣本制備：
iPSC-CMS:使用標(biāo)準(zhǔn)的分化方案衍生出人類iPSC-CMS。細胞在35毫米的培養(yǎng)皿上以不同的匯合度(20%和80%)進行培養(yǎng)。
初級心肌細胞:從8周大的C57BL/6小鼠左心室中分離出成年心肌細胞，并在分離后2-4小時內(nèi)將其鋪排在35毫米的培養(yǎng)皿上進行信號記錄。
系統(tǒng)設(shè)置：
熒光記錄使用lonOptix MultiCell 系統(tǒng)進行。FluoVolt的激發(fā)由470納米LED(Cairn)提供，并通過470/40x帶通濾波器。經(jīng)過濾波的激發(fā)光在顯微鏡內(nèi)被505納米二向色長通鏡(Chroma)反射，并通過UPlanXApo40x0.95 NA物鏡(olympus)聚焦于樣品上。FluoVolt的熒光信號經(jīng)過535/36帶通濾波器過濾，并使用光電倍增管進行檢測。主要的心肌細胞通過MyoPacer(lonoptix)進行電刺激，采用雙相脈沖模式(4毫秒持續(xù)時間，1赫茲頻率，20伏電壓。iPSC衍生的心肌細胞在無刺激情況下被記錄。
IonWizard設(shè)置
在lonWizard中，iPSC源性心肌細胞(iPSC-CMS)和初級心肌細胞實驗之間的主要設(shè)置差異是用于記錄熒光信號的采樣率。該速率需要超過動作潛能(AP)的速度，以避免遺漏重要的細節(jié)。

iPSC-CMs的 AP 通常較慢，因此可以使用較低的采樣率-例如250Hz、500 Hz 或 1000 Hz-。較低的采樣率也有助于減少噪聲，但可能錯過快速信號變化(圖1)。用戶應(yīng)根據(jù)動作電位的速度選擇采樣率。
原代心肌細胞的發(fā)射速度更快，因此采樣率至少需要1000赫茲。在某些情況下建議使用2000赫茲�；蛉硬蛔愕闹甘臼�，如果熒光信號在痕跡上的TTL步進信號之前達到峰值。如果發(fā)生這種情況，請?zhí)岣卟蓸勇省?/li>

圖1.較低的數(shù)據(jù)采集速率可能會導(dǎo)致欠采樣和數(shù)據(jù)信息減少，盡管信號更干凈。

方法(續(xù))
為了準(zhǔn)確捕捉心肌細胞中的電壓敏感染料信號，需要在lonWizard中進行兩項關(guān)鍵調(diào)
整:
1.在硬件管理器下配置硬件計時器(ZPT讀取頻率)
2.在實驗周期設(shè)置中設(shè)置采樣頻率。
以下是iPSC-CMs和初級心肌細胞的推薦計時器值和采樣率摘要

表2.在初級成年和iPSC衍生的心肌細胞中FluoVolt的加載后者使用了不同的協(xié)議以獲得相對的密度水平。

觀察結(jié)果
染料重新加載
在iPSC-CMs中重新加載FluoVolt是可能的，使用與初始應(yīng)用相同的裝載條件，在12小時后進行。
光毒性評估
在使用FluoVolt測量動作電位時，常見的問題是光毒性潛力和APD的假性延長。
iPSC-CMS:
記錄的30秒自發(fā)活動顯示沒有可檢測到的信號衰減(圖2A)，也沒有多個區(qū)域出現(xiàn)APD90延長(圖2B)。

圖2.(A)1代表性動作電位記錄，在iPSC衍生的心肌細胞(iPSC-CMs)分化后第10天以1000 Hz捕獲在室溫下于HBSS中記錄(B)APD90值，每簇跟蹤27個瞬態(tài)，未發(fā)現(xiàn)顯著延長跡象，表明無光毒性，n=5,N=1。

成年CMs-急性興奮測試:FluoVolt信號在受控的成年原代CM上記錄10秒(1Hz)。在對照條件下(HBSS)，多個細胞中均未觀察到動作電位峰后出現(xiàn)顯著平臺期(圖3A)或APD90延長(圖3B)，這表明FluoVolt刺激在此時間段內(nèi)未引起光毒性效應(yīng)或人為APD90延長。
為了解決細胞是否可以在10秒內(nèi)進行重復(fù)激發(fā)而不進行人工AP延長，以及它們是否對腎上腺素能刺激做出適當(dāng)反應(yīng)，我們進行了第二輪測量，添加10uM異丙腎上腺素(ISO)。在先前在HBSS下記錄的相同細胞中，APD90在第一個到第十個瞬變期保持穩(wěn)定(圖-3，C)。與HBSS處理的對照組相比，ISO處理導(dǎo)致APD90在多個細胞中的預(yù)期縮短(圖3、D和E)，這與其已知的生理效應(yīng)一致。
我們的研究結(jié)果表明，10秒的興奮不會誘導(dǎo)光毒性，作為動作電位的反應(yīng)保持穩(wěn)定的重復(fù)刺激時，記錄間隔幾分鐘，細胞保持正常的反應(yīng)腎上腺素能刺激。

圖3.(A)在1000赫茲下從小鼠成年心肌細胞獲得的代表性動作電位軌跡，記錄在HBSS中，溫度為37攝氏度。

成年鼠心肌細胞：圖3(續(xù))((B)在HBSS中對每個細胞的10個過渡期進行APD90測量，未觀察到顯著的延長，表明實驗條件沒有光毒性效應(yīng)。(C)APD90測定添加10μu異丙腎上腺素，每細胞嗾路0個瞬態(tài)，顯示無明顯延長，進一步證實重復(fù)測量后沒有光毒性。(D)異丙腎上腺素治療前后小鼠原代成年心肌細胞正�；瘎幼麟娢恍盘柕钠骄�(E)異丁腎上腺皮質(zhì)激素治療前后的APD90，與HBSS相比，異丁腎治療后的APD90顯著降低，表明對異丁腎上的腺皮質(zhì)興奮劑的預(yù)期反應(yīng)，數(shù)據(jù)使用配對2尾學(xué)生t試驗分析。面板D和E，數(shù)據(jù)以平均值土表示。

成年CMs-長時間激發(fā)測試:
為了評估長時間FluoVolt激發(fā)是否導(dǎo)致光毒性，原代心肌細胞被持續(xù)刺激(1Hz)，并在80秒內(nèi)記錄熒光信號。光毒性效應(yīng)大約在25秒后變得明顯，之后信號質(zhì)量逐漸下降(圖4)。
這對 lonOptix標(biāo)準(zhǔn)鈣信號和收縮力系統(tǒng)的用戶尤其重要，因為這些系統(tǒng)中長時間光暴露的可能性較高。為了在基于FluoVolt的記錄中最大限度地減少光毒性影響，我們建議采取以下措施:
將熒光信號采集限制在每個細胞的20秒內(nèi)。在定位新細胞時，通過點擊lonWizard實驗窗口中的暫停按鈕來暫停激發(fā)，以避免不必要的LED光暴露。使用光圈將激發(fā)限制為每次單個細胞。

對于Multicell Lite和MultiCell/MultiWell HTS用戶，當(dāng)光照為孔狀而非全場，且僅在活躍測量期間觸發(fā)LED時，仍建議:
限制每個單元格的采集時間為20秒
避免在同一感興趣區(qū)域(ROI)內(nèi)立即重復(fù)記錄。