疏水層析填料在重組蛋白純化中的應用

文章來自博格隆
疏水作用層析（Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC） 是蛋白質(zhì)純化技術(shù)體系中極具價值的一種分離手段。早在 1948 年，Tiselius 就提出了利用疏水相互作用進行分離的概念。與依賴分子電荷差異的離子交換層析不同，疏水層析利用蛋白質(zhì)表面疏水結(jié)構(gòu)差異實現(xiàn)分離——在高鹽環(huán)境中，疏水基團之間的相互作用被增強，從而促進蛋白質(zhì)與填料表面的結(jié)合。

在重組蛋白生產(chǎn)中，宿主細胞蛋白等雜質(zhì)通常親水性更強，而目標蛋白可能含有天然疏水結(jié)構(gòu)域（如抗體的恒定區(qū)）。這種物性差異賦予疏水層析在去除特定雜質(zhì)方面的天然優(yōu)勢。更重要的是，HIC 在工藝流程中的應用十分靈活——既可在高鹽條件下作為捕獲步驟，也可在中鹽條件下作為中度純化，也常用于在緩沖液條件稍作調(diào)整后與離子交換層析組合，實現(xiàn)精純目的。
 

• 結(jié)合–洗脫模式：工藝步驟通常包括平衡、上樣、清洗、洗脫和再生。一般在高鹽條件下將樣品上柱，高鹽環(huán)境可增強蛋白質(zhì)表面疏水基團與填料的相互作用，使目標分子結(jié)合在介質(zhì)上。上樣及清洗后，通過逐步降低洗脫液中的鹽濃度，依結(jié)合力強弱依次洗脫不同分子，從而實現(xiàn)分離純化。

• 流穿模式：選擇疏水性較強的填料，并在上樣時不添加鹽或僅添加低濃度鹽，使目標蛋白與填料幾乎不發(fā)生疏水作用，直接流出，而疏水性較強的雜質(zhì)被填料保留，實現(xiàn)雜質(zhì)去除。
 

Table 1. 疏水填料強弱應用介紹

注：填料的疏水性不僅取決于配基種類，還會受到配基密度及基質(zhì)性質(zhì)等因素的影響，從而改變其實際疏水強度。
 

獨特機制帶來的選擇性

• 基于疏水表面差異的分離：在高鹽（如 1.0~2.0M硫酸銨等鹽）條件下，疏水基團的溶劑化被削弱，蛋白更傾向與填料的疏水配基（苯基、丁基、辛基等）發(fā)生可逆結(jié)合；隨后通過降低鹽濃度（或加入溫和添加劑）使蛋白依結(jié)合強弱順序洗脫。

• 可有效區(qū)分電荷相近但疏水性不同的分子：（例如與目標蛋白等電點接近的 HCP）。這點與依賴電荷差異的離子交換形成互補。

• 溫和洗脫，保留活性：通過降鹽梯度洗脫，無需極端pH或高比例有機相（對比：RPC需高濃度有機試劑），最大限度保留蛋白天然構(gòu)象和生物活性。
 

關(guān)鍵應用優(yōu)勢

• 特定雜質(zhì)的高效去除

○ 宿主蛋白（HCP）：疏水性較強者在高鹽下結(jié)合更緊，可被選擇性去除。

○ 聚集體：因疏水表面積更大，優(yōu)先被吸附，洗脫晚于單體，有助于樣品聚體含量控制。

○ 內(nèi)毒素與核酸：在合適鹽種類與緩沖條件下，HIC可一定程度降低其共洗脫，但通常需與AEX流穿/TFF聯(lián)合使用以達到去除標準。

• 良好的工藝銜接與通量

○ 與離子交換/鹽析無縫銜接：高鹽樣品或經(jīng)硫酸銨沉淀處理后的樣品，可在調(diào)至目標鹽濃度且樣品澄清（0.22μm過濾）的前提下直接上柱，減少脫鹽/換液環(huán)節(jié)（是否免TFF視黏度/導電度窗口而定）。

○ 高通量友好：高剛性疏水填料（如Diamond Phenyl）具有良好的機械強度，可在較高線速度下運行，并可通過多柱切換/并聯(lián)提升產(chǎn)能與設備利用率。
 

案例一：某重組疫苗疏水步驟純化

• 介質(zhì)：Diamond Butyl Mustang

• 樣品：經(jīng)復合模式層析捕獲洗脫后樣品

• 流動相1：高鹽Buffer，pH7.0

• 流動相2：低鹽Buffer，pH7.0 

• 再生：超純水

Fig.1 某重組疫苗疏水步驟純化層析及電泳圖

實驗結(jié)果

疏水層析后SEC純度提高3%以上。

案例二：某重組蛋白疏水層析純化

• 層析柱：BXK16/20 10cm bed height, CV=20mL

• 介質(zhì)：Phenyl Bestrose 6 Fast Flow (high sub) 

• 樣品：酵母培養(yǎng)上清，加入0.5M硫酸銨

• 樣品體積：450ml (22.5 c.v.)

• 流速：300cm/h (loading) 60cm/h (elution)

Fig.2 某重組蛋白疏水純化層析圖譜

案例三：某重組蛋白疏水層析應用

• 介質(zhì)：Phenyl Bestrose 6 Fast Flow (high sub) 

• 樣品： 用0.22μm濾膜過濾后

• 流動相1：高鹽Buffer pH7.2

• 流動相2：低鹽Buffer pH7.2

Fig.3 某重組蛋白疏水步驟純化層析及電泳圖
 

配基選擇

• 短鏈烷基配基（丁基、丁硫基等）：

疏水性較弱，適合疏水性較強或穩(wěn)定性較差的蛋白，避免結(jié)合過強導致洗脫困難或活性下降。

• 長鏈烷基配基（辛基等）：疏水性中等偏強，適合疏水性中等的蛋白，通過增強結(jié)合力提高分離效率。

• 芳香族配基（苯基等）：疏水性最強，除疏水作用外，還可能參與π–π相互作用，對疏水性較弱、易流穿的蛋白尤其有效。

鹽的種類與濃度

• 促結(jié)合鹽選擇（Hofmeister 序列由強到弱）：硫酸銨 > 硫酸鈉 > 氯化鈉

• 常用濃度：

○ 上樣/平衡：1.0~1.5M硫酸銨（部分工藝可用至2.0M增強結(jié)合）。

○ 洗脫：線性降鹽或階梯降鹽濃度至接近0M。

注意：鹽濃度過高會增加溶液黏度、提升運行壓力，并在進柱端引發(fā)沉淀風險。

PH控制

• 建議范圍 pH 6–8：保持蛋白構(gòu)象穩(wěn)定，減少極端pH對配基和基質(zhì)的化學損傷。

• 對于構(gòu)象敏感或易聚集的蛋白，可在洗脫緩沖液中添加溫和助溶劑（如甘油、乙二醇）提高穩(wěn)定性。

疏水作用層析憑借高選擇性、溫和洗脫條件、特定雜質(zhì)的高效清除能力，已成為重組蛋白純化流程中不可替代的單元操作。

1. 對活性保持要求高且能耐受高鹽條件的酶、抗體等分子。

2. 電荷性質(zhì)與雜質(zhì)接近、難以通過IEX區(qū)分的蛋白。

3. 需要高效去除聚集體、疏水性HCP的工藝。

4. 鹽析或高鹽預處理后直接捕獲目標蛋白。

通過合理選擇配基、精確設定鹽種類與梯度，結(jié)合pH等條件優(yōu)化，并與AEX/TFF等單元操作協(xié)同設計，能在重組蛋白工藝中實現(xiàn)更穩(wěn)健的純度與回收率平衡。
 

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