冷晶體停搏液聯(lián)合保存液上調(diào)NR4A3借代謝重編程提升供心保護研究

瀏覽次數(shù)：549　發(fā)布日期：2025-8-25　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責任自負

研究背景：
心臟移植是應對終末期心力衰竭最為有效的治療手段，但心臟移植術(shù)后出現(xiàn)不良結(jié)果的風險也在顯著增加。當前供體心臟供應與臨床實際需求之間存在著明顯差距，制定科學合理的供體器官保存策略尤為重要。這樣的策略能夠拓展供體庫范圍或大幅提升邊緣供體心臟的實際可用程度，為更多患者帶來生機。

靜態(tài)冷保存（SCS）作為心臟移植中供體心臟保存的黃金標準方法，沿用至今。在心臟移植實踐中，威斯康星大學（UW）保存液的使用頻率位居榜首。但UW保存液存在一定局限性，在冷保存階段，它僅能降低細胞代謝速率，但無法使其完全停止。一旦移植物的缺血時長超過6小時，進行性缺血損傷難以規(guī)避。缺血時間的持續(xù)延長是公認的原發(fā)性移植物功能障礙（PGD）的一個關(guān)鍵風險因素，而PGD是導致術(shù)后低心輸出量綜合征的首要原因。

缺血時，代謝變化對心臟組織耐受缺血應激極為關(guān)鍵，缺血過程會消耗碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)等代謝營養(yǎng)素。同時，長時間冷缺血心臟發(fā)生PGD的分子機制尚不明確。SCS后的缺血 - 再灌注損傷，會因ROS生成、炎癥風暴及程序性細胞死亡導致PGD，低溫下受損線粒體產(chǎn)生活性氧，引發(fā)系列不良變化，觸發(fā)免疫反應。研究顯示，Nuclear receptor subfamily 4, group A, member 3（NR4A3）可能在心肌缺血 - 再灌注損傷中起關(guān)鍵作用，明確其機制和靶點，有助于創(chuàng)新SCS及心臟移植策略。

基于UW溶液在誘導快速心臟驟停和保存供體心臟方面的局限性，華中科技大學同濟醫(yī)學院協(xié)和醫(yī)院董念國教授團隊開創(chuàng)性地推出晶體停搏液（CC）聯(lián)合UW保存液的全新供體心臟獲取與保存方案。

研究結(jié)果：

1. 使用傳統(tǒng)UW溶液進行供體心肌保護，使心臟代謝重編程，缺血耐受性降低
為探討傳統(tǒng)UW溶液對供體心臟在SCS過程中代謝的影響，并確定其是否可用于長期SCS，通過非靶向GC/LC-MS對不同時間點接受SCS的豬心臟進行非定量代謝組學分析。發(fā)現(xiàn)使用UW保存液時，心臟收縮停止耗時久，能量代謝物消耗大，左、右心室代謝物變化顯著。D-葡萄糖持續(xù)消耗，不同時間點多種代謝物水平在左、右心室有不同變化，左心室在心臟泵血關(guān)鍵作用下，其不同時間點間的代謝物變化與對照組差異明顯。KEGG分析顯示特定代謝途徑相關(guān)代謝物在0小時升高后缺失，特定氨基酸代謝物水平持續(xù)下降。

圖1 使用UW溶液進行SCS時豬心臟的代謝變化

2. CC+UW法誘導供體心臟快速心臟驟停，減緩心臟代謝物的消耗
研發(fā)出CC+UW供體心臟獲取與保存新方法，該方法能快速使心臟收縮停止。相比UW，CC+UW法顯著減少SCS期間D-葡萄糖消耗，降低糖酵解通量，TCA循環(huán)（三羧酸循環(huán)）代謝物變化有特點，還能防止氨基酸消耗。小鼠同基因異位心臟移植實驗表明，經(jīng)8小時SCS后，CC+UW組心臟功能優(yōu)于UW組，心肌損傷更小，細胞凋亡程度更低，血清心肌酶濃度更低。

圖2 CC+UW方法可誘導供體心臟快速心臟驟停，并減緩心臟代謝物的消耗

3. CC+UW抑制核因子κB（NFκB）相關(guān)炎癥通路的激活
SCS期間，異常代謝會導致線粒體損傷，觸發(fā)促炎信號通路和級聯(lián)反應。左、右心室表現(xiàn)不同。利用磷酸化抗體芯片發(fā)現(xiàn)，4小時組差異磷酸化蛋白富集于與細胞死亡和周期相關(guān)通路，8小時組富集于炎癥相關(guān)通路，CC+UW組和UW組在三個時間點差異磷酸化蛋白均富集于NFκB通路。研究NFκB發(fā)現(xiàn)，隨SCS時間增加促炎蛋白磷酸化增加，抗炎蛋白磷酸化降低，CC+UW可降低p65等磷酸化，增加XIAP磷酸化。小鼠SCS模型驗證，抑制NFκB可減少心肌凋亡、ROS產(chǎn)生和線粒體損傷。

圖3 CC+UW方法改變了不同信號通路中富集位點的磷酸化，并降低了NFκB通路中p65（Ser529）的磷酸化

4. 單細胞核RNA測序（snRNA-seq）顯示，在經(jīng)CC+UW處理的心肌細胞中NR4A3基因表達上調(diào)
為探究調(diào)控NFκB相關(guān)炎癥通路的分子，進行snRNA-seq，將細胞分八類，心肌細胞和成纖維細胞占多數(shù)。提取心肌細胞細胞核進行PCA發(fā)現(xiàn)兩組轉(zhuǎn)錄有差異，CC+UW組NR4A3在各時間點上調(diào)最顯著且被驗證，該組NR4A3陽性細胞比例高且激活，UW組幾乎無活性。二次聚類分十個心肌細胞組，部分組NR4A3上調(diào)并定義為高表達細胞。分析顯示NR4A3hi_car細胞分化程度高，部分基因表達與NR4A3lo_car細胞有差異，XIAP 高表達。細胞通訊和基因關(guān)聯(lián)分析表明，NR4A3hi_car細胞與免疫細胞相互作用強，NR4A3lo_car細胞促炎基因表達高，CC+UW組 NR4A3上調(diào)或重塑轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡、抑制炎癥、增強心肌功能。

圖4 snRNA-seq揭示了左心室組織的細胞圖譜，并確定NR4A3為一個關(guān)鍵基因

5. SCS過程中，NR4A3過表達通過抑制雙特異性磷酸酶2（DUSP2）降低NFκB - p65（Ser529）的磷酸化水平
研究了NR4A3對小鼠心臟在SCS條件下的影響及其作用機制。通過尾靜脈注射過表達NR4A3的腺相關(guān)病毒，發(fā)現(xiàn)過表達NR4A3可減輕SCS誘導的小鼠心臟損傷，表現(xiàn)為左心室射血分數(shù)提高、ROS積累減少、細胞凋亡減少以及心肌損傷生物標志物（LDH、LDH1、CK、CK-MB）血清濃度降低。Western blot表明NR4A3可抑制p65（Ser529）的磷酸化。RNA測序和CUT&Tag分析發(fā)現(xiàn)NR4A3過表達影響的基因在細胞凋亡等信號通路中富集，且確定了與NR4A3相關(guān)的基因，其中DUSP2可激活NFκB通路且其啟動子與 NR4A3結(jié)合。進一步研究發(fā)現(xiàn)，NR4A3過表達可降低DUSP2蛋白水平，抑制DUSP2可降低 p65（Ser529）磷酸化水平、減少心肌細胞凋亡和ROS產(chǎn)生。綜上，NR4A3可能通過抑制DUSP2轉(zhuǎn)錄，降低p65磷酸化水平，減輕SCS對小鼠心臟的損傷。

圖5 SCS期間NR4A3過表達對小鼠心臟NFκB通路的影響

6. CC+UW可改善Langendorff灌注大鼠心室壓、電傳導和心律
在Langendorff灌流的大鼠心臟進行電標測實驗，以驗證CC+UW處理方法的效果。研究發(fā)現(xiàn)，CC+UW-8h組動脈波相似。在計算左室收縮期末峰值壓和左室舒張末期峰值壓后，發(fā)現(xiàn)CC+UW組在8h的脈壓變化大于對照組。上述結(jié)果表明，CC+UW可恢復大鼠心臟射血功能。

在電傳導方面，對照組和CC+UW-8h組呈現(xiàn)相似的等時圖和離散圖，與UW處理8小時組相比左心室電傳導性更強、傳導速度更快。其傳導離散程度和竇性心律恢復時間與對照組相當，UW處理8小時組則顯著增加。

心電圖評估顯示，CC+UW處理8小時組波形與對照組相似，心率略低，QRS和QT時間間隔短但因靜態(tài)冷保存較對照組有所延長，三組心室有效不應期相當。

綜上，CC+UW處理方法可增強電傳導和心室射血、減少心律失常并提高心臟移植存活率。

圖6 CC+UW對大鼠電生理標測指標的影響

7. CC+UW使得長時間冷缺血的供體心臟能夠被使用，并提高心臟移植后的中期生存率
利用臨床隊列對比了武漢協(xié)和醫(yī)院使用的CC+UW保存方法和UNOS數(shù)據(jù)庫中UW保存液的效果。納入360名CC+UW受者和13164名UW受者，發(fā)現(xiàn)CC+UW組供者冷缺血時間更長，兩組總體生存率相當。多因素Cox回歸分析表明，隨著冷缺血時間增加風險比上升，且CC+UW組冷缺血時間超過5.8小時風險顯著增加，而UW組超過3.3小時風險較高。KM生存分析顯示，UW組冷缺血時間≥6小時的供者生存率優(yōu)于<6小時的供者，CC+UW組兩組無顯著差異，且CC+UW 可擴大長時間冷缺血供者來源。因兩組存在差異難以進行傾向得分匹配（PSM），利用美國器官共享聯(lián)合網(wǎng)絡（UNOS）數(shù)據(jù)庫中281名CC+UW供者進行PSM匹配后發(fā)現(xiàn)，CC+UW組生存率顯著高于UW組，多因素Cox回歸分析顯示，使用UW保存液也是影響中期生存的一個危險因素，并且會對供體風險指數(shù)（DRI）和IMAPCT評分產(chǎn)生影響。