Visium和Xenium基因表達(dá)技術(shù)檢測靈敏度及分辨率詳細(xì)說明和對比
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新型空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)工具將傳統(tǒng)成像與分子分析相結(jié)合，為您提供所關(guān)注生物學(xué)現(xiàn)象的更完整圖景。無論您是試圖解析神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)雜性的神經(jīng)科學(xué)家、致力于更清晰揭示癌癥中腫瘤微環(huán)境的轉(zhuǎn)化研究人員，還是在探索其他眾多問題中的任何一個，空間層面的見解都為您的研究項目打開了新的大門。鑒于這些方法的前景及其日益廣泛的應(yīng)用，相關(guān)問題已從 “我為什么要開展空間生物學(xué)研究？” 轉(zhuǎn)變?yōu)?“我想通過空間生物學(xué)實現(xiàn)什么目標(biāo) —— 以及我應(yīng)該如何開展這項研究？”
為了幫助您提出自己想探究的問題，10x Genomics開發(fā)了兩種互補的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，用于超高 plex 水平的高分辨率空間分析：一種是基于 NGS（二代測序）的全轉(zhuǎn)錄組 Visium 空間基因表達(dá)技術(shù)；另一種是 Xenium基于靶向成像原位基因表達(dá)檢測技術(shù)，目前最大的Panel是Xenium Prime 5K，即5000-plex基因檢測。哪種方法最適合您當(dāng)前的應(yīng)用，或者它們是否應(yīng)該結(jié)合使用，取決于您的研究項目、研究目標(biāo)以及實際考量因素。
在這里我們就兩種技術(shù)的檢測靈敏度以及分辨率進(jìn)行詳細(xì)的說明和對比，并將10x Genomics今年最新上市的兩款空間產(chǎn)品Visium HD 3’ 和Xenium Protein介紹給大家。
在評估單基因靈敏度時，Xenium 檢測到的每個基因的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量約為 Visium HD 的 3.18 。不過我們注意到，這一計算結(jié)果會受到 Visium HD 所用測序深度的影響（Visium HD數(shù)據(jù)集平均飽和度為 65.43%）。在檢測轉(zhuǎn)錄本豐度時，Visium HD 總體檢測到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量平均約為 Xenium Prime 5K 的 1.54 。
在這組實驗中，Xenium Prime 5K 的單基因靈敏度高于 Visium HD。而 Visium HD 在基因檢出率和轉(zhuǎn)錄本豐度方面則優(yōu)于 Xenium。這主要是因為 Visium 可捕獲全轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，而 Xenium Prime 5K 僅靶向約 5000 個基因。此外，我們強調(diào)測序飽和度是因為，對于部分（并非所有）組織類型而言，當(dāng)測序深度超過我們?yōu)?Visium HD 推薦的深度時，可能會提高單基因靈敏度。這使得在某些組織和 / 或樣本中，轉(zhuǎn)錄本豐度和單基因靈敏度在一定程度上可通過測序深度進(jìn)行調(diào)整（請參考10x Technical Note, CG000775 Xenium Prime 5K Gene Expression Workflow, Analysis & Data Highlights）。
在 Visium HD 中，轉(zhuǎn)錄本被分配到一個比大多數(shù)單個細(xì)胞小得多的區(qū)域。具體來說，結(jié)合的探針通過 CytAssist 儀器精確轉(zhuǎn)移到捕獲區(qū)，該捕獲區(qū)有一片連續(xù)的寡核苷酸小方塊，這些寡核苷酸排列成數(shù)百萬個 2×2 µm 的帶條形碼方塊。這種基于測序的空間條形碼讀取，隨后以這些 2×2 µm 的方塊以及多種bin大�。ò� 8×8 µm 的bin，這是10x 推薦的分析起始bin大�。┹敵�。
由于這些方塊比單個細(xì)胞小，這種方法能夠表征每個bin中存在的主要細(xì)胞類型。鑒于這種bin策略以及真核細(xì)胞的平均大�。�10 至 100 µm），每個bin區(qū)域可能涵蓋不止一個細(xì)胞的組成部分，因此，bin的分析方法提供了我們所說的單細(xì)胞級分辨率。Space Ranger4.0版本分析軟件更新，在提供高清H&E 顯微鏡圖像時，會自動對 Visium HD 和 Visium HD 3' 數(shù)據(jù)執(zhí)行基于細(xì)胞核的細(xì)胞分割。
Xenium 原位技術(shù)可將轉(zhuǎn)錄本分配到單個細(xì)胞。在 Xenium 運行過程中，每個轉(zhuǎn)錄本都會被分配到組織內(nèi)的 X-Y-Z 坐標(biāo)上。隨后，儀器會在運行期間執(zhí)行多模態(tài)細(xì)胞分割，該過程利用多種形態(tài)學(xué)染色方法和專門構(gòu)建的人工智能算法來識別單個細(xì)胞的邊界。
之后，根據(jù)這些邊界及其空間坐標(biāo)，每個轉(zhuǎn)錄本會被分配到相應(yīng)的細(xì)胞中，且在細(xì)胞內(nèi)的定位精度達(dá)到納米級（X-Y 方向定位誤差＜50 納米，Z 方向定位誤差＜100 納米）。
Visium HD 3’ Gene Expression
所包含的標(biāo)志物經(jīng)過精心篩選，可提供穩(wěn)定可靠的檢測結(jié)果，能夠?qū)崿F(xiàn)全面的細(xì)胞分型以及對免疫微環(huán)境和腫瘤微環(huán)境的空間特征分析。
這些靈活的亞組與包含少于 500 個基因的基因 panel（即開即用型和定制化 RNA）以及人類福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織兼容。能讓您在同一張組織切片上實現(xiàn)真正的空間多組學(xué)分析，對免疫和腫瘤微環(huán)境進(jìn)行全面的細(xì)胞分型和空間表征。
北京怡美通德科技發(fā)展有限公司是10x Genomics的官方授權(quán)代理商，代理美國10x Genomics公司生產(chǎn)的Chromium單細(xì)胞測序建庫系列產(chǎn)品、Visium空間轉(zhuǎn)錄組系列產(chǎn)品以及Xenium組織空間原位分析系統(tǒng)，提供儀器配套的試劑耗材供貨、產(chǎn)品演示實驗、產(chǎn)品安裝、使用培訓(xùn)以及售前售后技術(shù)咨詢、生物信息學(xué)分析等相關(guān)技術(shù)服務(wù)。
如果您想了解更多關(guān)于10x Genomics的信息，歡迎掃描下方二維碼填寫信息，我們會在第一時間與您聯(lián)系！
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為了幫助您提出自己想探究的問題，10x Genomics開發(fā)了兩種互補的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法，用于超高 plex 水平的高分辨率空間分析：一種是基于 NGS（二代測序）的全轉(zhuǎn)錄組 Visium 空間基因表達(dá)技術(shù)；另一種是 Xenium基于靶向成像原位基因表達(dá)檢測技術(shù)，目前最大的Panel是Xenium Prime 5K，即5000-plex基因檢測。哪種方法最適合您當(dāng)前的應(yīng)用，或者它們是否應(yīng)該結(jié)合使用，取決于您的研究項目、研究目標(biāo)以及實際考量因素。
靈敏度
靈敏度指檢測轉(zhuǎn)錄本的能力強弱。雖然在空間技術(shù)領(lǐng)域中這一術(shù)語的使用范圍往往較廣，但它可以細(xì)分為：單基因靈敏度、基因檢出率和轉(zhuǎn)錄本豐度。
- 單基因靈敏度：指檢測方法能夠檢測到的每個基因的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量。這在差異基因表達(dá)分析、稀有轉(zhuǎn)錄本檢測、基因異構(gòu)體及變異體檢測等應(yīng)用中至關(guān)重要。結(jié)合基因檢出率（見下文），該指標(biāo)有助于確定檢測方法的動態(tài)范圍。
- 基因檢出率：在單基因靈敏度、檢測多重水平和組織類型的影響下，每個細(xì)胞或組織區(qū)域能夠檢測到的不同轉(zhuǎn)錄本種類數(shù)量�；驒z出率在基于發(fā)現(xiàn)的研究應(yīng)用中具有不可估量的價值，例如表征健康和 / 或疾病狀態(tài)下目標(biāo)組織的特征。
- 轉(zhuǎn)錄本豐度：每個細(xì)胞或組織區(qū)域檢測到的轉(zhuǎn)錄本總數(shù)�？捎糜谧R別整體基因表達(dá)的大規(guī)模變化。其計算取決于檢測方法的單基因靈敏度、基因檢出率、檢測 多重水平以及所分析的組織總面積。
在評估單基因靈敏度時，Xenium 檢測到的每個基因的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量約為 Visium HD 的 3.18 。不過我們注意到，這一計算結(jié)果會受到 Visium HD 所用測序深度的影響（Visium HD數(shù)據(jù)集平均飽和度為 65.43%）。在檢測轉(zhuǎn)錄本豐度時，Visium HD 總體檢測到的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量平均約為 Xenium Prime 5K 的 1.54 。
分辨率
涉及轉(zhuǎn)錄本的定位，即轉(zhuǎn)錄本被分配到特定的組織區(qū)域還是細(xì)胞，以及能夠觀察到轉(zhuǎn)錄本的最細(xì)微細(xì)節(jié)水平。在 Visium HD 中，轉(zhuǎn)錄本被分配到一個比大多數(shù)單個細(xì)胞小得多的區(qū)域。具體來說，結(jié)合的探針通過 CytAssist 儀器精確轉(zhuǎn)移到捕獲區(qū)，該捕獲區(qū)有一片連續(xù)的寡核苷酸小方塊，這些寡核苷酸排列成數(shù)百萬個 2×2 µm 的帶條形碼方塊。這種基于測序的空間條形碼讀取，隨后以這些 2×2 µm 的方塊以及多種bin大�。ò� 8×8 µm 的bin，這是10x 推薦的分析起始bin大�。┹敵�。
由于這些方塊比單個細(xì)胞小，這種方法能夠表征每個bin中存在的主要細(xì)胞類型。鑒于這種bin策略以及真核細(xì)胞的平均大�。�10 至 100 µm），每個bin區(qū)域可能涵蓋不止一個細(xì)胞的組成部分，因此，bin的分析方法提供了我們所說的單細(xì)胞級分辨率。Space Ranger4.0版本分析軟件更新，在提供高清H&E 顯微鏡圖像時，會自動對 Visium HD 和 Visium HD 3' 數(shù)據(jù)執(zhí)行基于細(xì)胞核的細(xì)胞分割。
Visium HD 3’ Gene Expression
產(chǎn)品亮點
- 新鮮冷凍組織樣本的多物種兼容性；
- 可實現(xiàn)De novo發(fā)現(xiàn)，包括isoform可變剪切、BCR/TCR 和 SNV 檢測的可行性；
- 檢測方法不依賴物種，且與蘇木精 - 伊紅（H&E）染色的新鮮冷凍組織切片兼容
工作流程
在使用 Visium CytAssist 之前，需通過組織切片、染色以及在載玻片上成像的方式制備組織切片。隨后，將兩張組織切片和一張雙捕獲區(qū) Visium HD 切片放入 CytAssist 儀器中，使組織切片與兩個 Visium 捕獲區(qū)對齊。在儀器內(nèi)部，首先會拍攝一張明場圖像，為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析提供空間定位。接著，對組織進(jìn)行透化處理，使組織中的 mRNA 分子能夠被 Visium HD 切片表面的 poly (dT) 序列捕獲。被捕獲的 mRNA 分子會經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程，在完成第二鏈合成后，這些產(chǎn)物會被轉(zhuǎn)移到試管中，從而啟動基因表達(dá)文庫的構(gòu)建流程。對于完全被組織覆蓋的 6.5×6.5 毫米捕獲區(qū)，建議最終的基因表達(dá)文庫測序深度至少達(dá)到 550 M reads pairs。Xenium Protein
Xenium原位蛋白檢測方案包含一套全面的 27 種免疫腫瘤標(biāo)志物。這些標(biāo)志物被分為 6 個不同的亞組，每個亞組包含 3-4 種標(biāo)志物。Xenium 蛋白亞組設(shè)計為可整體運行或模塊化運行，這種模塊化設(shè)計具有靈活性和易用性，因為預(yù)設(shè)的檢測組合無需進(jìn)一步優(yōu)化，且適用于多種組織類型。所包含的標(biāo)志物經(jīng)過精心篩選，可提供穩(wěn)定可靠的檢測結(jié)果，能夠?qū)崿F(xiàn)全面的細(xì)胞分型以及對免疫微環(huán)境和腫瘤微環(huán)境的空間特征分析。
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