哺乳動物原代細(xì)胞培養(yǎng)的β-半乳糖苷酶（熒光測定）

β半乳糖苷酶：β半乳糖苷酶由大腸桿菌lacZ基因編碼，可催化半乳糖苷水解。

最大優(yōu)勢是易于用免疫組織化學(xué)法觀測其原位表達(dá)，是最常用的監(jiān)測轉(zhuǎn)染率的報道基因之一。

以鄰—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷(ONPG)為底物可用標(biāo)準(zhǔn)的比色法檢測酶活性，其檢測動力學(xué)范圍為6個數(shù)量級。氯酚紅—β—D—半乳吡喃糖苷(CPRG)是另一個可用比色法檢測酶活性的底物，其靈敏度比ONPG高近10倍。以MUG和熒光素二半乳糖苷(FDG)為底物則可用熒光法檢測其活性。

此法可檢測單個細(xì)胞的酶活性，并可用于流式細(xì)胞學(xué)(FACS)分析。如以二氧雜環(huán)丁烷為底物，可用化學(xué)發(fā)光法檢測酶活性，其檢測動力學(xué)范圍最大，靈敏度最高，與用生物發(fā)光法檢測熒光素酶活性的靈敏度相似。

試劑和器材： 
1. 反應(yīng)緩沖液：100mmol/L醋酸鈉，100mmol/L KCl、2%（體積分?jǐn)?shù)）Triton X-100、5mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT），pH4.3；
2. 底物：1.7mmol/L4-甲基-傘形酮-β-D-半乳糖苷（4-MUG）或鄰—硝基苯—β—D—半乳吡喃糖苷(ONPG)，溶于反應(yīng)緩沖液中；
3. 微量離心機(jī)；
4. 熒光計：透射光波長355nm，激發(fā)光波長460nm，比色皿可容納200μl樣品；
5. 流式細(xì)胞學(xué)(FACS)分析
6. 37℃水浴鍋；

實(shí)驗方法：
哺乳動物原代細(xì)胞培養(yǎng)。
原代細(xì)胞收集后。
1. 用兩倍體積的緩沖液進(jìn)行稀釋，然后于0—4℃下在微量離心機(jī)中離心10min以獲得具有梯度的沉淀物；
2. 在0.25ml的反應(yīng)緩沖液中重懸沉淀；
3. 與等體積的底物進(jìn)行混勻，37℃孵育1h。使用0.25ml的反應(yīng)緩沖液代替底物來作為樣品空白；
4. 再配有一份底物空白；
5. 1h后測定熒光；
6. 流式細(xì)胞學(xué)(FACS)分析