從CB-MNCs中分離CD34+細胞

從CB-MNCs中分離CD34+細胞

試劑和材料：
1. 培養(yǎng)基；
2. 過柱緩沖液：pH7.2的PBSA，添加0.5%牛血清白蛋白和2mmol/L EDTA或0.6%枸櫞酸葡萄糖A方（ACD-A）。用真空裝置除去緩沖液中的氣體；
3. FcR阻斷劑；
4. CD34微球；
5. 柱子（MS+/RS+或LS+/VS+）；
6. 磁珠細胞分離儀（如MiniMACS）；
7. 尼龍過濾網(wǎng)，30μm；

實驗方法：
1. 準備過柱緩沖液，用抽真空裝置去除氣體；
2. 每108個CB-MNCs用終體積300μl緩沖液重懸；
3. 每108個CB-MNCs懸液加100μlFcR阻斷劑，抑制CD34微珠非特異性結(jié)合或通過Fc受體介導(dǎo)與非靶細胞的結(jié)合；
4. 每108個CB-MNCs懸液加100μlCD34微球進行細胞標記，充分混勻后在6-12℃冰箱放置30min；
5. 加PBSA洗，室溫200g離心100min；加適量的緩沖液重選細胞；
6. 根據(jù)CB-MNCs的細胞總數(shù)選擇合適的柱子類型（MS+/RS+或LS+/VS+），將柱子放入MACs分離儀的磁場中，加入緩沖液潤洗柱子（MS+/RS+：500μl；LS+/VS：3ml）；
7. 用30μm尼龍過濾網(wǎng)過濾細胞，去除細胞團。使用前，用緩沖液濕潤柱子；
8. 將細胞懸液加入柱子，使未結(jié)合的細胞通過柱子；
9. 用緩沖液將未結(jié)合的細胞洗去（MS+/RS+：3×500μl；LS+/VS：3×3ml）；
10. 洗脫結(jié)合的細胞；
（1） 將柱子從分離儀中移出；
（2） 置于合適的管中；
（3） 將柱子加滿緩沖液（MS+/RS+：1ml；LS+/VS：5ml）；
（4） 用柱子隨帶的內(nèi)塞，加壓將結(jié)合的細胞沖洗出來；
11. 加PBSA將CD34+細胞洗一遍，室溫200g離心10min。用適當?shù)呐囵B(yǎng)基重懸細胞；