胚胎顯微操作－細(xì)胞核移植

(一)概況
哺乳動(dòng)物核移植是指將胚胎單個(gè)卵裂球或體細(xì)胞核(核供體)移入去核的成熟卵母細(xì)胞或受精卵(核受體)中，采用一定的方法激活卵母細(xì)胞，使核供體和核受體融合為重構(gòu)胚，經(jīng)移植后發(fā)育成新個(gè)體的技術(shù)。通過(guò)核移植，可以不經(jīng)過(guò)有性繁殖過(guò)程，連續(xù)不斷地復(fù)制遺傳上相同的胚胎，再借用胚胎移植技術(shù)，生產(chǎn)大量基因型相同的動(dòng)物系或動(dòng)物群體。根據(jù)核供體的不同分為胚細(xì)胞核移植(胚胎克隆)和體細(xì)胞核移植兩種。

最早的核移植試驗(yàn)是用兩棲類做的。Spemann于1938年通過(guò)結(jié)扎蠑螈受精卵，使其一分為二，有核的部分正常卵裂并發(fā)育到16細(xì)胞階段，此時(shí)將一個(gè)卵裂球的核移入無(wú)核部分，結(jié)果獲得了兩只幼蟲(chóng)。Gurdon于1962年報(bào)道了囊胚細(xì)胞核移植后獲得了具有繁殖能力的小蟾的試驗(yàn)結(jié)果。兩棲類核移植試驗(yàn)為哺乳動(dòng)物核移植奠定了基礎(chǔ)。Illmensee和Hoppe于1981年獲得了核移植小鼠，Willadsen于1986年獲得了核移植綿羊。此后，牛、豬、兔、猴等動(dòng)物的胚細(xì)胞核移植也相繼獲得成功。國(guó)內(nèi)在山羊、兔、小鼠、牛、豬等動(dòng)物均獲成功。

目前在牛上，胚胎連續(xù)克隆已可獲得第6代克隆胚胎和第3代克隆犢牛，由1枚供核胚連續(xù)克隆最多獲得了190枚克隆胚胎。我國(guó)在胚細(xì)胞核移植方面也取得了重大進(jìn)展，尤其在山羊胚細(xì)胞克隆方面處于世界領(lǐng)先地位，已建立了山羊多個(gè)克隆胚胎系，可連續(xù)克隆5代，并獲得了后代，1枚胚胎經(jīng)5代連續(xù)克隆最多獲得了298枚克隆胚。此外，Wilmut等(1997)已成功地以綿羊乳腺細(xì)胞核為核供體，克隆出一只取名“多莉”的綿羊，首次在哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植方面獲得成功，這是核移植在理論和實(shí)踐上的重大突破。

胚胎細(xì)胞核移植技術(shù)對(duì)于畜牧業(yè)生產(chǎn)，科學(xué)實(shí)驗(yàn)及生物學(xué)基礎(chǔ)理論研究都具有非常重要的意義，表現(xiàn)在：1．該技術(shù)可使具有優(yōu)良性狀個(gè)體的后代在群體中大量增殖，大大加速遺傳改良和育種進(jìn)程；2．可以迅速擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后代的數(shù)量，提高轉(zhuǎn)基因技術(shù)的效率；3．胚胎經(jīng)性別鑒定后再進(jìn)行核移植，可以獲得大量的期望性別的胚胎；4．核移植技術(shù)可用于珍稀動(dòng)物品種的擴(kuò)繁與保存；5．核移植技術(shù)對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)也存很重要的意義，基因型相同的個(gè)體可提高實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)的有效性，從而可以大大減少試驗(yàn)樣本的數(shù)目。

(二)核移植技術(shù)的操作過(guò)程

1．供體核的分離技術(shù)

(1)胚細(xì)胞

用0.2％鏈霉蛋白酶預(yù)處理胚胎，然后機(jī)械法剝離透明帶，鈍頭玻璃吸管反復(fù)吹吸以分離成單個(gè)卵裂球。有兩大重要進(jìn)展：1)胚胎干細(xì)胞系的建立——發(fā)育階段上類似于內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞，是早期胚胎經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)建立的多能性細(xì)胞系，可以傳代增殖，通過(guò)核移植可望獲得無(wú)數(shù)個(gè)遺傳上完全一致的動(dòng)物�，F(xiàn)僅在小鼠上獲得成功，在豬、牛、綿羊等家畜只分離到類胚胎干細(xì)胞，是今后一個(gè)重要的研究方向。2)綿羊TNT4細(xì)胞系的建立一顯微分離胚盤(pán)細(xì)胞并在體外進(jìn)行缺血饑餓傳代培養(yǎng)，誘使細(xì)胞處于“靜止”狀態(tài)以便調(diào)整染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，有助于核的重組與發(fā)育，形態(tài)上類似于胚胎干細(xì)胞，但更偏平、上皮化。該方法系Campbell等1996)所創(chuàng)立，曾被評(píng)為1996年世界十大科技新聞之—。

(2)體細(xì)胞

1997年，Wilmut等取綿羊乳腺細(xì)胞在特定實(shí)驗(yàn)條件下增殖培養(yǎng)6天，誘使細(xì)胞處于“靜止”狀態(tài)，以便其染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)整，核進(jìn)行重組，經(jīng)核移植后獲得了后代，開(kāi)創(chuàng)了哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植成功的前例。

2．受體細(xì)胞的去核技術(shù)

(1)以原核期受精卵或2細(xì)胞期胚胎為受體卵 去除原核或細(xì)胞核，成功率低，已很少采用。

(2)以排出卵為受體卵

將超排回收的卵母細(xì)胞或體外培養(yǎng)成熱的卵母細(xì)胞置于含細(xì)胞松馳素B和秋水仙胺的培養(yǎng)液中，通過(guò)操縱顯微操作儀，一端用固定吸管吸住胚胎，另一端用一尖玻璃吸管(Φ30um)穿透透明帶進(jìn)入卵周隙，或用一細(xì)長(zhǎng)玻璃針刺破并切一部分透明帶，再用呈直角的去核吸管經(jīng)切口抵住細(xì)胞膜，操縱去核吸管從第1極體處吸除第1極體以及處于分裂中期的染色體和周圍的部分細(xì)胞質(zhì)。

3．核卵重組技術(shù)

在顯微操作儀下，用去核吸管吸取一枚分離出的完整卵裂球，注入去核卵母細(xì)胞的卵周隙中。

4．卵母細(xì)胞的激活與細(xì)胞融合

核移植技術(shù)操作過(guò)程中的關(guān)鍵步驟是卵母細(xì)胞的激活及其與核供體的融合。人工激活卵母細(xì)胞的方法很多，如采用電刺激，改變溫度或滲透壓，透明質(zhì)酸醇，鈣離子載體，蛋白質(zhì)合成抑制劑等。電刺激激活卵母細(xì)胞的機(jī)理在于這一處理可使細(xì)胞內(nèi)游離鈣的濃度升高，使細(xì)胞靜止因子(CSF)和成熟促進(jìn)因子(MPF)失活，從而解除CSF與MPF對(duì)卵母細(xì)胞分裂的抑制作用，使卵母細(xì)胞活化并完成第二次減數(shù)分裂。電刺激的激活效果優(yōu)于其它幾種方法，在試驗(yàn)研究中被廣泛采用。

核受體和核供體的融合一般采用兩種方法，一種是利用仙臺(tái)病毒誘導(dǎo)重組胚融合，另一種是電融合法，具有激活卵母細(xì)胞與誘導(dǎo)膜融合的雙重作用．即通過(guò)一定場(chǎng)強(qiáng)的直流脈沖刺激，使二者相鄰界面的細(xì)胞膜穿孔，形成細(xì)胞間橋從而達(dá)到融合。電融合是在由一種非電解質(zhì)(如0.3M的甘露醇)和兩根相近的微細(xì)電極(0.2～1mm)組成的融合小槽內(nèi)進(jìn)行。融合過(guò)程中適宜的脈沖場(chǎng)強(qiáng)和持續(xù)時(shí)間是極其重要的兩個(gè)參數(shù)。在不同的畜種這兩個(gè)參數(shù)整異極大，而且還隨電極間的距離、融合液的種類等變化。為了使細(xì)胞易于融合，需將卵母細(xì)胞和卵裂球緊密接觸，并且接觸面應(yīng)垂直于電場(chǎng)方向。在上述兩種融合方法中，仙臺(tái)病毒為感染性病毒，其融合率低且不穩(wěn)定，故已逐漸被舍棄。目前采用電刺激融合法，適宜的參數(shù)及熟練操作可使融合率達(dá)到96％。

5．核移植胚的培養(yǎng)與移植或重復(fù)克隆技術(shù)

融合后的胚胎經(jīng)體外或中間受體培養(yǎng)至桑椹胚或囊胚，然后移入與胚齡同期的受體動(dòng)物子宮角內(nèi)，可望獲得克隆后代。獲得的早期胚胎也可以作為供體核重復(fù)克隆。