BioArray訪談：Charles Lee談微陣列技術(shù)的現(xiàn)狀與未來

2009年9月

新聞通訊： 

《BioArray News》

Justin Petrone 撰文

職位：哈佛癌癥研究中心細胞遺傳學(xué)主任；哈佛醫(yī)學(xué)院副教授；麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)Broad研究院準教員；布里格姆婦女醫(yī)院臨床細胞遺傳學(xué)家；

 

2002年，通過美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)委員會的臨床細胞遺傳學(xué)認證；

1998-2001年，在哈佛醫(yī)學(xué)院攻讀博士后學(xué)位；

1996-1998年，在英國劍橋大學(xué)攻讀博士后學(xué)位；

1996年，獲得加拿大阿爾伯塔大學(xué)遺傳學(xué)博士學(xué)位；

1990年，獲得阿爾伯塔大學(xué)遺傳學(xué)學(xué)士學(xué)位。

 

在近十年的大部分時間里，Dr. Charles Lee設(shè)在波士頓的實驗室一直專注于利用最新的分子細胞遺傳學(xué)技術(shù)來研究脊椎動物的基因組結(jié)構(gòu)，以此加深對人類疾病的了解。

Dr. Charles Lee目前從事的研究主要涉及三個部分：將分子細胞遺傳學(xué)工具用于模式生物的開發(fā)及應(yīng)用；基因組結(jié)構(gòu)變異；以及癌癥生物標記的識別與特征化。

Dr. Charles Lee 還是基因組結(jié)構(gòu)變異識別與解釋方面的權(quán)威，他積極投身于目前正在進行的1000 基因組計劃，還加入了基因組結(jié)構(gòu)變異聯(lián)合會，利用自身在細胞遺傳學(xué)上的豐富經(jīng)驗，以及微陣列和第二代測序等技術(shù)，幫助更好地探索人基因組結(jié)構(gòu)變異。

為了解細胞遺傳學(xué)界目前對這些最新技術(shù)的運用情況，《BioArray News》在上周采訪了Dr. Charles Lee。以下是采訪記錄。

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我曾在阿爾伯塔大學(xué)攻讀遺傳學(xué)本科學(xué)位，我很喜歡這門科學(xué)，因為我發(fā)現(xiàn)攻讀遺傳學(xué)更多地需要理解概念和解決問題，而不是對事實的死記硬背。在我大四的時候，我在C.C. Lin的帶領(lǐng)下參與了一個研究項目，Lin既是阿爾伯塔大學(xué)附屬醫(yī)院的細胞遺傳學(xué)主任，同時還是一個熱點研究實驗室的負責(zé)人。我對像他這樣能成功地兼顧治療與研究的人很敬仰。我對研究的熱情就是這樣慢慢培養(yǎng)起來的，我發(fā)現(xiàn)自己很擅長顯微鏡檢查，當看到染色體顯色時我就很有成就感，這比單純地觀察凝膠中的譜帶有趣多了，而且我能積極利用最新的細胞遺傳學(xué)技術(shù)，這都讓我很有滿足感。

在此之后，我開始從事兩項博士后研究，一項為基礎(chǔ)研究，另一項涉及臨床細胞遺傳學(xué)。我的第一個博士后研究是與英國劍橋大學(xué)的 Malcolm Ferguson-Smith 一同進行的。他是世界知名的細胞遺傳學(xué)家，致力于研究尖端的分子細胞遺傳學(xué)技術(shù)，包括光譜核型分析、Rx-FISH、染色體流式分揀與涂染，以及性別判定和產(chǎn)前診斷方面的研究。而我的臨床細胞遺傳學(xué)培訓(xùn)是與哈佛醫(yī)學(xué)院的Cynthia Morton一同進行的。現(xiàn)在，我已成為美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)委員會的認證會員，平時我有20％的時間在布里格姆婦女醫(yī)院提供臨床細胞遺傳學(xué)方面的服務(wù)，此外我在BWH/哈佛醫(yī)學(xué)院負責(zé)一家23人的研究室，我把剩余80％的時間都花在那里。對我來說，這一時間分配是最為平衡的。

在阿爾伯塔大學(xué)時我們做了大量的 G帶染色體分析，那時剛開始在采用特定基因座的染色體涂染探針的原位雜交中使用熒光技術(shù)。后來我到了劍橋大學(xué)，那里的實驗室使用了許多先進的分子細胞遺傳學(xué)技術(shù)，包括光譜核型分析、染色體流式分揀、跨物種染色體涂染和纖維FISH。當時陣列技術(shù)還未進入實驗室，因為首個陣列 CGH 論文直到1997年才公布與世。

您從何時開始接觸微陣列技術(shù)？

2003年，我在哈佛醫(yī)學(xué)院剛從講師升任助理教授，并設(shè)立了我自己的研究實驗室，能夠從事基于陣列的比較基因雜交實驗。但在那時，我們還遠遠未在aCGH 領(lǐng)域占據(jù)領(lǐng)先地位。那時在該領(lǐng)域走在前列的是加州大學(xué)舊金山分校的 Dan Pinkel 和Joe Gray、英國桑格中心的Nigel Carter 、荷蘭內(nèi)梅亨大學(xué)的 Joris Veltman 等人。正是這些舉足輕重的人物在不久后的將來讓所有的細胞遺傳學(xué)家都能利用aCGH 技術(shù)進行研究或臨床診斷。

您最早使用的是哪種類型的陣列平臺？

那時所用的陣列主要是基于BAC的陣列，含有約150 K堿基的插入 DNA。一開始我們也考慮過自己開發(fā)陣列，但我的實驗室剛起步不久，顯然沒有足夠的人力和財力這么做。于是有人向我引見了一家新成立的名為Spectral Genomics的公司，他們生產(chǎn)供aCGH 實驗所用的BAC陣列。我先試用了他們的小鼠BAC陣列，發(fā)現(xiàn)他們有許多BAC克隆圖譜都是錯誤的。在約1／3的克隆中，不僅染色體基因圖有誤，甚至還將不同的非同源染色體列入了圖譜。當我把我們的FISH 驗證實驗結(jié)果給他們看后，他們請我擔任該公司的無薪顧問。這是了解陣列生產(chǎn)詳情和解決aCGH實驗疑難問題的大好機會。

其發(fā)展情況如何？

之后，我們從有效分辨率約為3 Mb、每個陣列約含1000個克隆的Spectral Genomics小鼠陣列轉(zhuǎn)而使用有效分辨率相近、每個陣列約含1000個克隆的Spectral Genomics人陣列。如你所知，現(xiàn)在我們已將每個陣列約1000個克隆提升至每個陣列約200多萬個寡核苷酸。

隨后，我們又轉(zhuǎn)向了每個陣列約含3000個克隆的Spectral Genomics人陣列，對于人基因組得失的有效分辨率約為1 Mb。這個時候，曾參與我的首個博士后研究的John Iafrate 開始著手測試用于臨床細胞遺傳學(xué)診斷的陣列。作為一名優(yōu)秀的科學(xué)家，他率先進行了陣列對照實驗。其中一項對照實驗是對兩位健康的正常人的基因組DNA進行比較。根據(jù)我們在遺傳學(xué)課程和人基因組項目中得到的數(shù)據(jù)，健康的正常人的［基因組］相似性達到99.9％，其差別主要在SNP上。由于此類陣列平臺無法檢測出SNP，我們原本預(yù)期在這些對照實驗中將看到“平坦線路”概貌。但在對39位無血緣關(guān)系的健康的正常人經(jīng)過測試后，結(jié)果顯示每位測試對象都出現(xiàn)了大規(guī)模的基因得失，這顯然讓我們大吃一驚。接著，我們與多倫多病童醫(yī)院的Stephen Scherer 聯(lián)手將這些結(jié)果整理到一個數(shù)據(jù)庫中，也就是現(xiàn)在的基因變異數(shù)據(jù)庫。我們把研究成果寫成論文，并將原稿投給了英國《自然遺傳學(xué)》雜志。這篇論文于2004年8月1日在網(wǎng)上公布。在我們的論文發(fā)表一周后，由冷泉港實驗室的Jonathan Sebat 和Michael Wigler 率領(lǐng)的研究團隊撰寫的另一份論文也刊登在了美國《科學(xué)》雜志上，他們的研究結(jié)果與我們是一致的。這些基因得失— 現(xiàn)稱為拷貝數(shù)變異（CNV）— 是目前已知的人基因組結(jié)構(gòu)變異中的最大組成部分，且成為了人遺傳學(xué)研究中一個令人振奮的領(lǐng)域。CNV還能在臨床aCGH 診斷法的準確解釋中給出直接的提示。

我們幾乎已不再使用基于BAC的陣列了。主要是因為寡核苷酸陣列在質(zhì)量和分辨率上都有了實質(zhì)性的改善。憑此，甚至有可能開發(fā)出結(jié)合多張載片數(shù)據(jù)的自定義陣列集。例如，我們組建的基因組結(jié)構(gòu)變異聯(lián)合會— 負責(zé)人是Stephen Scherer、Matthew Hurles、Chris Tyler-Smith、Sanger中心的Nigel Carter和我— 已構(gòu)建并使用了一個分布于20張載片的含4200萬個寡核苷酸探針的NimbleGen 微陣列芯片，以500bp的有效分辨率深入了解個人基因組的CNV。我們還與首爾國立大學(xué)的教授Jeong-Sun Seo合作，開發(fā)出一個分布于24張載片的含2400萬個寡核苷酸探針的陣列集，在人身上獲得相似的CNV檢測有效分辨率。我們實驗室還有一些工作是開發(fā)模式生物的 CNV譜圖，為完成這一任務(wù)，我們專門針對黑猩猩、獼猴和鼠構(gòu)建了自定義陣列。

我們依然在做大量的FISH。原因是任何技術(shù)都有其局限性，包括aCGH，所以我認為FISH和aCGH可以成為互補的技術(shù)。對陣列CGH來說，其主要的局限是無法在染色體重排上獲得平衡。雖然可以檢測到基因得失，但舉例來說，會在患有畸形和發(fā)育遲滯的兒童身上檢測到額外的染色體物質(zhì)。你不知道這些額外的染色體物質(zhì)是否在同一個染色體位點上呈串連排列，或額外的染色體物質(zhì)是否位于其他染色體區(qū)域內(nèi)，甚至是在另一個非同源染色體上。在臨床環(huán)境下，當詢問一位帶有額外染色體物質(zhì)的兒童的父母時，串聯(lián)重復(fù)和非串聯(lián)重復(fù)這兩種情況所表示的含義可能截然不同。對這名兒童的染色體進行FISH研究能提供額外物質(zhì)的染色體位點的信息，而對其父母的FISH研究可能顯示出平衡的染色體重排，與這一重排相關(guān)的是，其他帶有額外染色體物質(zhì)的兒童的復(fù)發(fā)風(fēng)險有所增加。

如你所知，aCGH一詞是在為兩個DNA樣本貼標時用到的，其中一個是測試DNA樣本，另一個是正常的參考DNA樣本，兩者所用的熒光染料不同，并將已標記的DNA共雜交到單個陣列上。SNP陣列是基因分型陣列，最初是專門用來檢測單個核苷酸替代，而不是基因組得失的。現(xiàn)在，Affymetrix 和 Illumina 已經(jīng)采用了新的SNP 陣列設(shè)計，包括新增了專門檢測拷貝數(shù)變化的探針。一般情況下，它們能通過雜交信號強度變化和識別明顯SNP純合性的延長來推斷出拷貝數(shù)的變化。由于只將一個已標記的基因組雜交到每個SNP陣列中，在將實際得到的數(shù)據(jù)與參考數(shù)據(jù)集進行比較后，可獲得一部分已推斷的CNV。

新設(shè)計的SNP陣列的一大優(yōu)點是能在單個平臺上獲得SNP和CNV數(shù)據(jù)。對于基因組相關(guān)性研究來說，這意味著能減少DNA輸入以及試劑、人工和成本， 而通常的SNP陣列檢測和aCGH 測定需要分開進行。不過，此類SNP陣列也有一些需要引起科學(xué)家們關(guān)注的重要局限性。舉例來說，Affymetrix 6.0 芯片一般用來檢測大小約為30 kb 或更大的常見CNV。此類芯片不太可能檢測出罕見CNV，特別是當其大小低于30 kb時。同樣地，Illumina 660W 平臺也不是用來檢測罕見CNV的，即使作為其靶向的較小型常見CNV，該平臺的檢測有效性也只有約63%— 這可能是對許多CNV靶區(qū)域缺乏足夠的信息探針所致。Illumina 近來還新增了另一種新的SNP微珠陣列設(shè)計—  Omni 陣列�？上У氖�，由于這一產(chǎn)品剛推出不久，我們還無法對這一陣列的CNV檢測能力做出評估。如今市面上的CNV檢測商用平臺品種繁多，很有必要對所有的陣列平臺做逐一比較—  這正是基因組結(jié)構(gòu)變異聯(lián)合會目前正在著手做的。

我前面已經(jīng)提過，應(yīng)當對不同的技術(shù)進行一項公正且全面的比較研究，以評估每種平臺可檢測與無法檢測的具體方面。我認為，對于大規(guī)模的基因組失衡，大部分平臺都能檢測出來。解釋上可能出現(xiàn)的偏差主要存在于較小的基因組上，特別是當這些基因組被嵌入或靠近帶有片段重復(fù)或其他重復(fù)性元素的復(fù)雜基因組區(qū)域時。

在臨床診斷中，對陣列平臺實施標準化將很有幫助。現(xiàn)有的標準化機構(gòu)— 細胞遺傳學(xué)陣列國際標準化聯(lián)合會由埃默里大學(xué)的David Ledbetter 和Christa Lese Martin負責(zé)，他們的目標是對體質(zhì)細胞遺傳，最終對圍產(chǎn)期細胞遺傳病例做出準確的解釋。該聯(lián)合會正在嘗試設(shè)立相關(guān)的最低要求，比如，此類臨床細胞遺傳學(xué)診斷陣列應(yīng)當檢測出哪些靶區(qū)域，應(yīng)獲得的最低有效分辨率是多少。該團體還力爭讓所有的成員都能共享陣列數(shù)據(jù)，幫助對拷貝數(shù)變化做出準確的解釋。這樣的話，每位細胞遺傳學(xué)家就能根據(jù)自己的意愿選擇適合的平臺，只要其陣列滿足ISCA設(shè)立的最低要求即可。至于癌癥細胞遺傳學(xué)目前所用的陣列，現(xiàn)在美國杜蘭大學(xué)的Marilyn Li正在帶頭設(shè)立一個癌癥細胞遺傳學(xué)陣列聯(lián)合會。

如果我沒理解錯的話，你的意思是指，隨著正常人拷貝數(shù)變異信息資料的日益增多，我們是如何實施轉(zhuǎn)化型研究或臨床研究項目的。這無疑是個持續(xù)的挑戰(zhàn)。過去五年來，基因組變異數(shù)據(jù)庫將已公布的健康正常人的CNV檢測數(shù)據(jù)都收編到目錄中。當然，所有的CNV項目在檢測中都出現(xiàn)了一定程度的假陽性率，比例在5%-20%甚至更高，而這一信息不可避免地被錯誤地列入了正常變異中。對于臨床細胞遺傳學(xué)家來說，我們參考基因組變異數(shù)據(jù)庫中的信息，對病人的CGH陣列結(jié)果中出現(xiàn)的基因組失衡的致病性做出解釋。簡單地說，在健康的正常人身上出現(xiàn)的基因組失衡不太可能在臨床識別的病人身上成為病原。但我們知道基因組變異數(shù)據(jù)庫中存在假陽性數(shù)據(jù)，所以不能僅根據(jù)這些標準來解釋某位病人的基因組失衡。令人慶幸的是，我們還可以結(jié)合數(shù)十年來細胞遺傳學(xué)家們在全基因組重排上一直使用的標準。舉例來說，如果在某位病人身上發(fā)現(xiàn)染色體重排，同時其健康的雙親中有一方也存在這一情況，那么就不太可能視之為病原。當然這也有例外。比如，當病人出現(xiàn)染色體缺失，其健康的母親的缺失情況看起來與之一樣時，但病人的染色體缺失顯露出隱性突變 — 其母親則沒有這一突變，那么兩者的表型效應(yīng)也有很大差別。

顯然，所有的臨床細胞遺傳學(xué)家在解釋陣列CGH結(jié)果時都必須格外小心，充分利用現(xiàn)有的所有臨床數(shù)據(jù)和網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，如基因組變異數(shù)據(jù)庫和DECIPHER，以及基因組失衡的內(nèi)容，同時與遺傳學(xué)顧問緊密合作，幫助他們告知病人，陣列CGH解釋雖然不是絕對正確的，但是根據(jù)我們所獲得的大量相關(guān)信息做出的。雖然我不想這么說，但有時候，在解釋基因組失衡上是有點小技巧的。我想，隨著時間的推移，我們獲得的基因型及相應(yīng)的表型數(shù)據(jù)將越來越多，結(jié)果解釋也將變得越來越容易和準確。當然了，在進行產(chǎn)前陣列CGH測試時應(yīng)格外謹慎，應(yīng)將此類測定結(jié)合其他現(xiàn)有信息一同使用，如超聲檢查結(jié)果和家族史等等。

在過去，對發(fā)育遲緩和畸形患者的基因測試的黃金標準是G帶核型，其中有高達98%的病例都為正常核型。而現(xiàn)在采用 aCGH測試后，在同樣的病例中，能檢測出18%的反常結(jié)果病例。這代表了檢出率的顯著提升，促使歐洲許多臨床實驗室和北美的部分實驗室開始將aCGH測試作為首要的測試方法，優(yōu)于G帶核型。采取這一策略能幫助臨床實驗室節(jié)省大量時間和資源。

有趣的是，有些人認為，使用分辨率更高的陣列能持續(xù)提高臨床實驗室對反常結(jié)果的檢出率。但根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)來看，這一假設(shè)似乎并不成立。因為當我們利用較高分辨率的陣列時，我們可能將檢測出更多的良性 CNV，而不是更明顯的致病基因組失衡。

除基因組失衡外，片段單親雙體— 即兩種等位基因僅衍生自單親的基因組區(qū)域，有時也會成為臨床基因致病性。比如，新生兒患有Prader-Willi綜合征的比率約為1／25000，且可能是由父系遺傳基因組序列在15q11-q13染色體區(qū)的缺失造成的。據(jù)我推測，還有其他許多遺傳疾病也是由特定的片段單親基因組區(qū)所導(dǎo)致的。與染色體缺失相關(guān)的此類區(qū)域可用aCGH檢測到。如果單親基因組區(qū)域為二染體，或存在于兩個拷貝中，那么aCGH將無法檢測出畸變。但SNP陣列就能做到。所以我預(yù)計，能檢測出基因組失衡的SNP陣列或能獲得SNP信息的 aCGH平臺將更多地在臨床中得到應(yīng)用。

當然有影響。在我們的研究實驗室里，約有1／4正在進行的項目會用到某種新一代DNA測序。我不認為新一代測序很快會在臨床上取代基于陣列的各種技術(shù)，但隨著DNA測序率的持續(xù)下降，與外顯子組測序、甚至全基因組測序有關(guān)的研究項目日益涌現(xiàn)。

目前，我們的研究實驗室已參與了1000基因組計劃。我們的實驗室專屬于其中的基因組結(jié)構(gòu)變異分析團體。我們和其他幾個團體一起，主要采用較短的、約105 bp的配對序列讀數(shù)，設(shè)法準確地解釋經(jīng)測序的每個人的基因組結(jié)構(gòu)變異。盡管我們在開發(fā)和驗證許多不同的計算機算法上取得了顯著的進展，但依然任重道遠�？雌饋碜R別基因組結(jié)構(gòu)變異要比識別SNP困難得多。

目前在我們的實驗室進行的研究中，有3／4 與某種形式的結(jié)構(gòu)變異識別或特征化有關(guān)，包括人類與模式生物。有人勸我少接一些項目，將精力專注于少數(shù)幾個最重要且有潛在影響的項目。但實際上要做到這一點不太容易。在人類與模式生物的基因組結(jié)構(gòu)變異上仍有許多未知的信息—  比如這些變種處于哪個位點上，它們的基因組影響如何，隨后這些變種又會生成哪些表型，包括疾病易感性等，我對充分利用有限的時間和現(xiàn)有資源來揭示這些答案充滿了興趣�？吹轿覠崆楦邼q的樣子，一些同事開玩笑說，他們認為我也患有輕度的多動癥。我想他們是對的。

直到最近，我們一直非常依賴于各家陣列生產(chǎn)公司推出的軟件。我們也會使用其它獨立平臺分析算法開發(fā)公司的軟件產(chǎn)品，比如BioDiscovery的Nexus程序。但在去年，我們幸運地請到 Ryan Mills加盟我們的研究團隊，他是一位資深的生物信息學(xué)家，也是卓越的團隊領(lǐng)導(dǎo)者，在分析新一代DNA測序數(shù)據(jù)和識別基因變異上頗有研究。他為我們的研究團隊注入了無法估量的價值。我無法想象，如果缺少優(yōu)秀的生物信息學(xué)家，任何基因組研究或臨床實驗室將如何運作下去。我知道臨床細胞遺傳學(xué)家在北美很稀缺，但我估計，如今對生物信息學(xué)家的需求更為旺盛。

如果在兩年前，確實只有頂尖的實驗室才會使用。但這一情況在發(fā)生改變。雖然不是很清楚確切數(shù)字，但據(jù)我估計，本國至少有20家甚至更多的實驗室現(xiàn)以某種形式采用了陣列CGH技術(shù)。作為美國人類遺傳學(xué)協(xié)會程序委員會的成員，我發(fā)現(xiàn)今年有關(guān)aCGH的研究摘要比往年多出許多。我們的會員即將在夏威夷聚首，交流和分享彼此的科研成果，這無疑是件讓人振奮的事 — 原因之一是，現(xiàn)在aCGH已經(jīng)不再是一流實驗室的專利，而得到了廣泛的普及。讓細胞遺傳學(xué)家熱血沸騰的時刻終于到了。

 

 

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